מטרת פרוטוקול זה היא לזהות שיטה אשר ניתן להשתמש בהם לזיהוי גנים חדשניים המעורבים איתות סידן. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים במסך הגנטי הקלאסי קדימה. איתות סידן הוא מסלול תגובה ביטחוני חשוב במספר מערכות צמחים.
על מנת לזהות את הגנים המעורבים במסלול זה, השתמשנו במסך הגנטי הקלאסי קדימה. בשיטה זו, EMS ישמש כסוכן alkylating להציג מוטציות אקראיות במערכות הצמח. לאחר מכן ניתן להשתמש בדור המוטנטים המפותח להקרנה עבור פנוטיפ של עניין.
לאחר שזיהו את הפנוטיפ של העניין, ניתן למפות את הגן הסיבתי. במחקר זה, אנו משתמשים בצמח המודל Arabidopsis אשר יש aequorin כתב הסידן בספקטרום שלה. לשקול 150 זרעי מ"ג של aequorin עבור MUTAGENESIS EMS ועוד 150 זרעי מ"ג לשמש שליטה.
מעבירים את הזרעים לצינור פלקון 50 מ"ל ומוסיפים 2%EMS או מים אוטומטיים. בעת שימוש ב- EMS, היזהר כי זה מסרטן. יש ללבוש הילוכים מגן בעת השימוש ב- EMS ויש למנוע כל סוג של שפיכה.
לאטום את צינורות פלקון עם פרפין ולעטוף אותו רדיד אלומיניום. סובב את קצה הצינור מעל הקצה במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר. אפשר את הזרעים להתיישב ולהסיר את פתרון EMS בזהירות להשליך במיכל פסולת המכיל אחד molar NaOH.
לשטוף את הזרעים mutagenized ביסודיות עם 40 מ"ל של מים autoclaved לפחות שמונה פעמים. לשטוף הסופי, להוסיף 100 מילימולאר נתרן thiosulfate ולשטוף לפחות שלוש פעמים כדי להסיר עקבות של EMS. משרים את הזרעים ב 40 מ"ל של מים autoclaved במשך שעה אחת כדי לפזר EMS מתוך הזרעים ולאחר מכן למקם אותם על נייר Whatman עד יבש לחלוטין.
מעבירים את הזרעים לאפנדורף ודורגים בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עד ארבעה ימים לריוד. מעבירים הן את הזרעים המושתקים והן את הזרעים המטופלים במים על אדמה ומעבירים אותם לחדרי צמיחה עם אור של 16 שעות ותהומת צילום כהה של שמונה שעות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-70% לחות יחסית. כדי לקבוע אם mutagenesis היה מוצלח, לחפש סקטורינג כלורופיל.
השתמשנו בשיטת איסוף הזרעים היחידה המבוססת על אילן יוחסין וכל צמח M1 מקבל מספר ייחודי. עם התבגרותם, זרעים נקצרים מצמחים מוטנטים בודדים אלה ומאוחסנים כקווי M1 בודדים. נעשה שימוש בסטריליזציה של זרעי תפוקה גבוהה ופרוטוקול שורש של צמחים הידרופוניים, המותאם מ- Ranf et al.
ביום הראשון, מקום כמעט 12 עד 15 זרעי M2 לכל M1 שורה אחת בארות בודדות של צלחת תרבות רקמות 24 היטב לעיקור באמצעות hypochlorite נתרן ותווית חומצה הידרוכלורית ביחס של שלושה הוא לאחד. זה משחרר גז כלור שמחקר את הזרעים. השאירו את הצלחת ללילה כדי להתאדות גז כלור שנותר לחלוטין.
לאחר עיקור, מוסיפים חצי כוח נוזלי MS מדיה בארות בודדות לשכבות הזרעים במשך יומיים עד ארבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את הזרעים לתא צמיחה עם תקופת צילום של אור 10 שעות ו 14 שעות כהה ב 22 מעלות צלזיוס, 70% לחות יחסית. ביום 14, לאחר השתילים הם 8 עד 12 ימים, מקום 12 שתילים M2 מכל שורה בנפרד בצלחת 96 היטב זוהר. לאחר העברת שתיל, להוסיף 150 microliters של חמישה פתרון קולנטרזין micromolar בארות בודדות ולאחסן בחושך ב 21 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות.
Coelenterazine היא קבוצה תותבת אשר נקשר אפואקורין כדי ליצור aequorin פונקציונלי. Coelenterazine הוא רגיש לאור ולכן מאוחסן בבקבוקים בצבע כהה מוגן מפני אור. למחרת, מוטנטים מסך באמצעות מי חמצן כמו גירוי ולמדוד העלאת סידן הבאים.
למדידה בו זמנית של 24 בארות, נעשתה תוכנית קינטית אוטומטית החוצה, הכוללת מדידת הרקע לדקה אחת, ואחריה תוספת גירוי ומדידה במשך 10 דקות, ואחריה הזרקת פריקה 150 מיקרוליטר ומדידה במשך שלוש עד חמש דקות. וכל פריקה עבור aequorin הבת תיכלל בקריאה לכמת את הסידן הנמדד כבקרה נוספת עבור aequorin תפקודי. הקריאות הנ"ל נמצאות ביחידות תאורה יחסיות.
לחישוב ריכוז יון סידן ציטוסולי, נעשה שימוש במשוואת ריכוז שתוארה בעבר על ידי Rental and Knight בשנת 2004, המתוארת בפרוטוקול. RLUs המתקבלים זוהר מתווספים למשוואה כדי לחשב את ריכוז יון הסידן. ערכי יון הסידן הציטוסוליים המתקבלים מותווים לאחר מכן בצורה גרפית נגד בקרה מסוג פראי לזיהוי מוטציות מי חמצן לשם לתגובת סידן.
זוהי תוצאה מייצגת של הפרוטוקול המוצג. הראינו קו M1 אחד עם 12 שתילים בודדים שנמדדו להעלאת ריכוז יון הסידן. הקו הירוק בגרף מציין אקורין פראי שנמדד יחד עם מוטנטים.
אדום הוא ממוצע של כל 12 השתילים, ואת הקו השחור הוא שתילים בודדים M2 נמדד עבור גובה יון הסידן. שתילים המראים תגובה מופחתת מאוד ליישום מי חמצן הם הצילו לאחר מכן. לאחר מכן, מוטנטים שניצלו מאושרים מחדש בדור הבא, ולאחר מכן מיפוי לזיהוי גנים סיבתיים.
זהירות צריכה להינתן בעת שימוש ב- EMS כמו mutagen מאז זה מסרטן. הילוכים מגן צריך להיות משוחק בכל עת וכל שפיכה שנעשתה צריך להיות מטופל עם שיטות מעבדה טובות. בנוסף, כאשר עושים אוסף מבוסס אילן יוחסין של זרעים, צמחים בודדים יש לקצור בזהירות מירבית, כך שאין ערבוב של זרעים כלשהם בכל שלב.
זה יעזור אחד לחזור ולעקוב אחר צמח האם, שהוא צמח מוטנט הומוזיג. בנוסף, מאז שיטה זו אינה מציגה כל הטיה או כל הנחות קודמות לתוך שיטת המיון, זה יכול לשמש עבור תנאים אחד או יותר כדי לזהות פנוטיפ של עניין. בנוסף, ניתן לזהות גנים עצמאיים מרובים גם באמצעות אותו פרוטוקול.
הפרוטוקול קל לשימוש שכן עם המינון הקטן, מספר עצום של צמחים ניתן mutagenized. מספר עצום זה של צמחים מוטנטים יכול לשמש עבור מספר אוכלוסיות עבור מספר תנאים ולזהות מספר גנים. אובדן תפקוד חלקי, פונקציה שהשתנתה, אובדן תפקוד מוחלט, או גם תפקוד גנים מכופתר ניתן לזהות באמצעות שיטה זו.
מיפוי צריך להיות משימה קלה בהתחשב בקידום בטכנולוגיות מיפוי בתרחישים הנוכחיים. מערכת מיפוי מבוססת דה נובו, מזימה גזעית מבוססת SNP ורבים אחרים יכולים לשמש לזיהוי הגן הסיבתי הגורם לפנוטיפ העניין. בהתחשב ביישום של שיטה זו, ניתן להשתמש בו לא רק על הצמחים מודל Arabidopsis, אבל מפעלי מודל אחרים מדי בתנאי כי פנוטיפ של קריאה עניין ניתן ליצור.
