פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לנתח את המנגנונים של חלוקת התא בהקשר של חיים, רקמות שלמות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהסביבה הפיזיולוגית של התאים נשמרת, וגם מאפשרת הדמיה חיה לאורך קורסים ארוכים. החלק החשוב ביותר בטכניקה זו הוא לוודא כי האשכים אינם פגומים במהלך ניתוח או הרכבה.
זוהי מיומנות שנרכשת עם קצת זמן ותרגול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, משום שהיא מראה כיצד לזהות ולבודד את האשכים, וכיצד להרכיב אותם להדמיה מבלי לפגוע ברקמה. הכן בעלי חיים, כלים ומדיה כמתואר בכתב היד.
לפני תחילת הניתוח, השתמש במזרק המסנן מלא המדיה כדי לגרש שלוש טיפות מדיה כל 50 מיקרוליטר בחלק העליון, האמצעי והתחתון של שקופית זכוכית. באמצעות בדיקה לנתח, להעביר חמישה עד 10 זחלים instar שלישי או גלמים מוקדמים לירידה העליונה של מדיה על השקופית. בעדינות להתסיס את הזחלים ואת הגלמים בתקשורת עם בדיקה לנתח כדי להסיר כל מזון או פסולת.
השתמש בבדיקה לנתח כדי להפוך זחלים בודדים או גלמים על צידו. חפש את שני האשכים הדו-צדדיים המופיעים כמבנים אליפטיים שקופים בשליש האחורי של הגוף. בעלי חיים חסרי אשכים הם נקבות, ויש להשליך אותם.
כאשר זחלים זכרים או גלמי נמצא והוא נקי, להעביר אותו טיפה השנייה של התקשורת. חזור על הפעולה עד ששלושה או ארבעה זחלים זכרים או גלמיות הועברו לירידה השנייה של התקשורת. ואז לעבוד בירידה השנייה של התקשורת, לתפוס חיה אחת עם זוג ממטרים במרכז האזור שלה, רק לפני האשכים.
השתמש בזוג מדפים שני כדי לקרוע בעדינות את החיה לשניים. באמצעות זוג מדפים, החזק את הקצה האחורי של החיה למטה על מגלשת הזכוכית. החל ממש ליד המדפים, לדחוף למטה על קוטיקל באמצעות קצה האזמל.
להזיז את האזמל לכיוון הקצה החתך של החיה. פעולה זו תגרש את האיברים הפנימיים של החיה, הכוללים את המעיים, גופי השומן וה האשכים. האשכים הם איברים אליפטיים חסרי צבע וכמעט שקופים המוטמעים בסרטים של גוף שומן.
בעדינות להקניט את האשכים משאר האיברים. כדי להעביר את האשכים אחד בכל פעם, להכניס את קצה האזמל מתחת לגוף השומן, להרים את הרקמה מהתקשורת, ולהעביר אותו במהירות לירידה השלישית. אם אין מספיק גוף שומן עדיין מחובר האשכים כדי להרים את הרקמה עם אזמל להשתמש פיפטה פסטר זכוכית כי כבר prewetted עם מדיום ניתוח.
עבודה בירידה השלישית של המדיום, להשתמש בקצה החד של האזמל כדי לחתוך בעדינות את גוף שומן עודף מן האשכים, משאיר רק שפה קטנה של גוף שומן סביב הקצוות. ראשית, השתמש במזרק המסנן כדי להפקיד טיפה אחת של המדיום של שניידר על 30 microliters על מרכז צלחת תרבות חדירה גז 50 מילימטר. באמצעות הכלי אזמל או פיפטה פסטר prewetted להעביר עד חמישה האשכים מוכנים טיפה על המנה.
לאחר מכן, השתמש בכלי האזמל כדי לדחוף בעדינות את האשכים אל קרום הגז חדיר, ולתוך מרכז טיפת המדיום. בעזרת מזרק מיליליטר אחד, מניחים ארבע טיפות שמן ההלוקרבון על קרום הגז החודר המקיף את טיפת המדיום. מיקומי הטיפות צריכים להתאים לארבע הפינות של כיסוי מחלקה של 22 מילימטר.
לאחר מכן ליישר את הפינות של כיסוי זכוכית 22 מילימטר עם ארבע טיפות שמן halocarbon בעדינות להוריד את כיסוי על התקשורת ושמן. אפשר לכיסוי להתיישב, ולתקשורת המכילה את האשכים את התפשטות בין טיפות השמן. מניחים את צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ ניתוח.
כדי להסיר מדיה עודפת, הכנס את הפינה של מחיקת משימה עדינה מתחת לכיסוי. Wick משם מספיק מדיה עבור כיסוי הזכוכית רק כדי ליצור קשר עם פני השטח של האשכים הגדולים ביותר. אל תסיר יותר מדי מדיה והורד את הכיסוי רחוק מדי.
זה יפעיל לחץ על האשכים ועשוי לגרום להם להיקרע. לבסוף, מניחים טיפה של שמן טבילה על כיסוי הזכוכית ממש מעל האשכים. הופכים את המנה, ומ מניחים אותה על במת המיקרוסקופ.
הזז את המטרה מיקרוסקופ 40 או 60 X לתוך השמן עד שהוא ממש מתחת האשכים. השתמש באור משודר כדי למצוא אשך יחיד ולהביא אותו לפוקוס. מניחים 0.5 מיליליטר של 8% paraformaldehyde ב PBSTx ב באר אחת של תשעה צלחת לנתח היטב.
השתמש פיפטה פסטר זכוכית להעביר עד 10 של האשכים ל הבאר. ודא כי האשכים שוכבים על החלק התחתון של הבאר. לאחר 20 דקות, להעביר את האשכים ל הבאר המכילה 0.5 מיליליטר של PBSTx.
לשטוף את האשכים על ידי תסיסה בעדינות במשך חמש דקות. לשטוף פעמיים נוספות בארות חדשות עם PBSTx טרי. להכין דילול של הנוגדן העיקרי בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר כמתואר בכתב היד.
ואז להעביר את האשכים מתשעת צלחת לנתח זכוכית היטב לצינור. דגירה הצינור לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה או אגוזים. ההליך להכתמת האשכים בנוגדן המשני דומה.
עיין בכתב היד לקבלת פרטים. ראשית, באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את האשכים מתשע צלחת גם על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. במידת הצורך, השתמש בקצה האזמל כדי לדחוף את האשכים אל פני השטח של השקופית.
לאחר מכן, השתמש בפינה של מחיקת משימה עדינה כדי לפתיק נוזל עודף מהתרכים. הסר נוזלים רב ככל האפשר. לאחר מכן להחיל טיפה 30 עד 50 microliter של מדיום הרכבה מיקרוסקופיה על האשכים.
לבסוף, מניחים כיסוי 22 מילימטר על טיפת מדיום הרכבה. אפשר לכיסוי להתיישב, ואת המדיום הרכבה להתפשט מתחת לכיסוי. במידת הצורך, יש להפעיל לחץ עדין על המכסה כדי לסחוט מדיום הרכבה עודף ולאפשר לכיסוי לנוח על פני האשכים.
כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, הארגון התאי של האשכים נשמר, והתקדמות ההבחנה בין התאים מקצה אחד של האשך לקצה השני גלויה. זרע עומד להתחיל meiosis ואלה metaphase ניתן לזהות. בבדיקה שהוכנה באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח הדמיה חיה מראה את הארגון מחדש הדינמי של הרשתית האנטופלסמית ומיקרו צינוריות בחלוקת זרעונים.
כפי שמתואר בפרוטוקול, יש לדאוג מאוד לא להפעיל לחץ שגורם לאשמים להתפוצץ. ציסטות של זרעונים זורמות במהירות מתוך אשכים קרועים, מה שהופך את הדמיה זמן חי לשגות קשה. פרוטוקול זה מותאם להדמיית זרע חלוקת זרע ברקמות חי, שלם.
לכן, חיוני כי האשכים אינם פגומים במהלך ניתוח או הרכבה. השיטה שלנו צריכה להתאים גם לטכניקות הדמיה ברזולוציית-על, כגון מיקרוסקופיית תאורה מובנית, המספקת תובנות חדשות על תהליכים תת-תאיים דינמיים השולטים בחלוקת התאים.
