שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון המנגנונים של נדידת תאים עצביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לזהות הגירת תאים בודדים וקולקטיביים בטווח הארוך. לאחר בידוד 200 מיליליטר של תרבות חיידקית בשיטת תמיסת אלקליין, מערבבים את שתי הפלסמידים, כך שהריכוז הסופי של כל אחד מהם הוא ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.
הדגירה של ביצי העוף הפוריות אופקית ב-38 מעלות צלזיוס ב-70% לחות יחסית. לאחר יומיים וחצי, השתמש במזרק 20 מיליליטר עם מחט מד 18 כדי לחסל חמישה מיליליטר של אלבומין מהצד המחודד של הביצה. לאטום את החור עם קלטת.
לאחר מכן, השתמש במספריים מעוקלים כדי לחתוך את החלק העליון של קליפת הביצה ולפתוח חור, שני סנטימטרים קוטר. תחת סטריאומיקרוסקופ, בדוק את השלב ההתפתחותי של העובר. לאטום את החור הגדול הזה עם קלטת.
ממשיכים את הדגירה בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ו-70 אחוז לחות יחסית עד E5.5. לפני אלקטרופורציה, להכין 10 microliters של ה-DNA פלסמיד שהוזכרו בצבע עם 0.5 microliters של ירוק מהיר. כמו כן, להכין 10 מיליליטר של PBS autoclaved המכיל 100 יחידות למיליליטר של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין.
השתמש במעבד מיקרופיט להכנת מיקרופיטים עשויים צינורות נימי זכוכית. חותכים את הקצה הדיסטלי של micropipette לגודל נקבובית מתאים עבור כמות ה-DNA להיות מוזרק. השתמש במספריים כדי לחתוך את הקליפה העליונה האטומה כדי לפתוח מחדש חור, שני סנטימטרים וחצי קוטר, ולהגדיר את הביצה ביצית בתוך מיקרוסקופ סטריאו.
הפקד כמה טיפות של פתרון PBS מוכן לתוך הביצה. באמצעות שני מטחנים עדין, לקלף את הממברנה allantoic מכסה את העובר, נזהר לא לגרום לדימום. לאחר מכן להסיר את amnion מהראש של העובר.
בעת סיבוב הראש עם microspatula, להשתמש micropipette מחובר צינור יניקה, כדי להזריק בין 0.1 ו microliter אחד של ה-DNA הצבעוני לתוך חלל החדר של טקאטום אופטי שמאל. מניחים זוג מלקחיים סוג אלקטרודות סביב אזור היעד של טקאטום אופטי. השתמש במחולל הדופק כדי לטעון פעימה מוקדמת של 30 וולט למשך אלפית שנייה עם מרווח של חמש אלפיות שנייה, ולפולסים הבאים של שישה וולט במשך חמש אלפיות שנייה עם מרווח של 10 אלפיות שנייה.
אחרי כל זה, לאטום את החור עם סרט, ולהמשיך דגירה ב 38 מעלות צלזיוס ו 70 אחוז לחות יחסית. משרים את האלקטרודות בכלי פלסטיק מלא PBS, ולהשתמש במברשת interdental כדי להסיר את האלבום. חזור על התהליך מחיתוך הקליפה הראשונית לאלקטרופוזיה עבור כל ביצה.
יום אחד לפני תרבות Flat-Mount, החל להכין את תרבות התאים המקודדים הוסף על ידי הוספת autoclave למים מזוקקים לצלחת תרבות תאים 10 ס"מ. לצוף קצת תרבות תאים מוסיף על המים. בתתוצר המכיל שמונה מיקרוגרם למיליליטר למינין, ו-80 מיקרוגרם למיליליטר פולי L, הקפדה לכסות את ההוספות.
אינקובט לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני תרבות התא. ביום התרבות ב E7.0, הסיר את פתרון למינין ופולי l-ליסין מן הכנס. לאחר מכן, להעביר את הכנס לצלחת תחתית זכוכית מלא 1.1 מיליליטר של מדיום תרבות.
מעבירים את המנה לתרבות התאים חממת פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. הגדר יחידת תא לח על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם זרימת גז של 40% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני, וטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל להכין דגימת רקמה על הכנס, להשתמש מדפים כדי לצבוט את הראש העובר לתוך צלחת תרבות תאים שישה סנטימטר המכיל HBSS קר כקרח.
השתמש בשני מלקחיים עדין כדי לבודד את טקאטום אופטי אלקטרופולד. ואז להשתמש טפטפת פלסטיק להעביר אותו לתוך צלחת זכוכית קעורה מבוסס עם סיליקון שחור ומלא HBSS קר כקרח. בדוק את מיקום התיוג תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי.
באמצעות סכין מיקרו כירורגית, לחתוך את רקמת tectal המקיף את התיוג תוך שים קץ לכיוון הרקמה ב tectum. לאחר מכן, השתמש בטפטפת פלסטיק כדי להעביר את הרקמה המסוווית לתוספת כך שהצד של הסיכה מחובר לתוספת. מניחים את רקמת העצם בכיוון הרצוי ולהסיר כל HBSS עודף.
חזור על תהליך הכנת הרקמה עבור כל דגימות רקמה אחרות המיועדות לאותו הכנס. לאחר מכן מניחים את המנה בתא המעוצב מראש של המיקרוסקופ הקונפוקל ההפוך. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל הפוך, לבדוק את תיוג פלואורסצנטי ולמקד את השדה המיקרוסקופי.
הפעל את יחידת הקונפוקל בלייזר. דגימת סריקת הקונפוקל על מנת להתאים את הכיוון והמיקום של הרקמה לאורך צירי x ו- y בשדה. לאחר מכן, בחר את גודל הסריקה.
החלט על מרווח הזמן והטווח הכולל של סריקת הקונפוקל לאורך ציר z. קח מרווח של חמישה או 10 מיקרומטר לטווח 100 מיקרומטר. בחר את מרווח הזמן של דימות הקונפוקל ואת משך הדימות הכולל.
לאחר הגדרת הפרמטרים של התוכנית הפועלת על-ידי הקונפוקל, התחל בהדמיה. לאחר השלמת ההדמיה, שילבו את תמונות הקונפוקל בציר C שונה כדי להפיק תמונות מחסנית z עם התאמת מוקד סופית בכל נקודת זמן. לאחר מכן צרפו את תמונות המחסנית Z בנקודות זמן שונות כדי לבנות סרט לשגות בזמן.
במחקר זה, נדידת תאים מזוהה בשכבות שטחיות באמצעות אלקטרופורציה באובו, תרבות תאי הרכבה שטוחה והדמיה קונפוקלית של זמן לשגות. התאים הנודדים באופן משיק והגרעין בשכבות השטחיות של הפקטום האופטי נראים כאן אפס שעות, תשע שעות, 18 שעות ו-27 שעות לאחר תחילת ההקלטה. סרט לשגות זמן של מרווחי זמן של 10 דקות על פני תקופה של 28 שעות ו 50 דקות, מראה את התנועה ההמונית של תאים נודדים ואת הגרעינים שלהם.
הסרט הממוזג מראה בבירור את תנועת ההמונים של התאים הנודדים. הכיווניות של נדידת התאים יכולה להיבחן על ידי התמקדות בתאים המתפזרים מהמרכז המסווים לכל הכיוונים. התמונות הברורות של התנועה הגרעינית, מאפשר מעקב אוטומטי של ההגירה הגרעינית באמצעות תוסף מעקב חלקיקים.
ניתן לדמיין שינויים זמניים במסלולי הנדידה המשיק ולהוכיח שההגירה המתפזרת היא רב-כיוונית. תמונות הגדלה גבוהות יותר ניתן לנקוט במרווחים של חמש דקות. כדי לחקור התנהגות תא בודדת עם השינוי המורפולוגי הרציף של התהליך המוביל, התהליך הנגרר והגרעין.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע תיוג של פעולות מאירות. כדי לענות על שאלות נוספות כמו מנגנוני ההנחיה של אקסום.
