הכימות של נגעים טרשת עורקים ב apoE וסוגים אחרים של עכברים היפרליפידמיים הוא המפתח להערכה של גורמים גנטיים שונים וטיפולים חדשים. הפרוטוקול שלנו מספק הוראות שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים באופן איכותי וכמותי בעכבר יחיד. 16 שבועות לאחר גרימת טרשת עורקים, לפני זלוף הלב, לטעון מזרק 10 מיליליטר עם 10 מיליליטר של DPBS לצרף מחט 25 מד.
הרם את עור הבטן של העכבר הניסיוני עם פינצטה והשתמש במספריים עדינות כדי לחתוך את העור מבסיס הבטן לחלק העליון של הצוואר. פתח את דופן הבטן מתחת לבית החזה והשתמש בפינצטה כדי להרים את עצם החזה כדי לגשת לסרעפת. חותכים את הסרעפת וחותכים את בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה.
לאחר מכן, לעשות חתך קטן באטריום הימני של הלב ולאט לאט להזריק את כל הנפח של DPBS לתוך ניקוב החדר השמאלי apical. הכבד והכליות יהפכו לחום בהיר בצבע. כאשר כל מלוחים כבר perfused, להשתמש ספוג לא ארוג כדי לנקות את חלל החזה של כל דם זר ונוזל.
לאחר חלל החזה כבר ניגב, להסיר את האיברים שאינם ניסיוניים לחתוך את עצם הבריח עם פינצטה ומספריים עדינים. מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ סטריאו ומשתמשים בפינצטה ובמספריים הקפיצים כדי לנתח את אבי העורקים. כאשר אבי העורקים מבודד, לכסות את הרקמה עם ספוג לא ארוג ספוג מלוחים ולנתח את ענפי אבי העורקים כולל brachiocephalic, עורק הראש, subclavian, הכליה, איליאק משותף, עורקי הירך.
כאשר כל העורקים המסתעפים מאבי העורקים מבודדים, השתמשו בפינצטה ובמספריים קפיציים כדי לנתח ולהסיר בזהירות את השומן ההרפתקני ורקמת החיבור סביב ענפי אבי העורקים ואבי העורקים. בידוד מוצלח של אבי העורקים וענפי אבי העורקים דורש תרגול וסבלנות. כדי לתקן את עץ כלי הדם, תחילה לטעון מזרק 10 מיליליטר עם 4% פורמלדהיד ב 1X DPBS ולצרף מחט 25 מד.
זכור תמיד להכין 4% פורמלדהיד בתוך מכסה המנוע אדים. הכנס את המחט לתוך ניקוב החדר השמאלי האפילי ולהזריק לאט את כל הנפח של fixative. נקו את חלל החזה של נוזלים זרים עם ספוג לא ארוג כפי שהוכח והשתמשו בפינצטה ובמספריים קפיציים זעירים כדי להפריד את הלב מאבי העורקים.
כאשר הרקמות הופרדו, לבודד ולחתוך את אבי העורקים ואת כלי הדם העיקרי שלה ממילימטר אחד מעל העורק הראשי עד סוף עורק הירך ומניחים את הכלי במיכל של DPBS. להכתמת Oil Red O של אבי העורקים המלא שלא נפתח, השתמשו בסיכות מינוטין כדי לאבטח את הכלי על צלחת פטרי שעווה ולשטוף את הכלי עם DPBS טרי. יוצקים לצלחת 25 מיליליטר של תמיסת שמן אדום O טרייה של 0.45 מיקרומטר עם סינון נקבוביות, לכתם של 60 דקות בטמפרטורת החדר.
הטביעו את הרקמה ב-60% איזופרופנול לכביסה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הכלי שלוש פעמים עם מים מזוקקים טריים במשך חמש דקות לכל לשטוף ומניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ המנתח. השתמש פינצטה ומספריים באביב כדי לנקות בעדינות את כל רקמת שומן perivascular סביב אבי העורקים, כדי למנוע כל רקע שווא שמן אדום O הכתים ולהעביר את הכלי למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה.
שמן אדום O יסמן את הפלאק העשיר בשומנים אדום, משאיר את הלא פלאק המכיל אזורים חיוורים בצבע. לאחר מכן רכשו מיקרוגרפים דיגיטליים ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ אור המצויד במצלמה ושמרו את התמונות רצוי בתבנית קובץ תמונה מתויגת. עבור הרכבה פנים של מדגם רקמת אבי העורקים, להעביר את הכלי לצלחת פטרי שעווה ולכסות את הרקמה עם DPBS טרי.
חתוך את עורקי הראש ואת העורקים התת-בריחיים של קשת אבי העורקים ואת עורקי איליאק באבי העורקים בבטן 1 עד 2 מילימטרים לאחר bifurcations. תנתק את עורקי הכליות. לאחר מכן, השתמש במספריים קפיץ ניתוח מיקרו כדי לפתוח את הכנת אבי העורקים לאורך העקמומיות הפנימית ואת עורקי iliac ולחתוך את שלושת הענפים של קשת אבי העורקים לאורך העקמומיות הגדולה יותר עד לרמת הבסיס של העקמומיות הפנימית.
לאחר מכן השתמש סיכות Minutien כדי לאבטח את אבי העורקים שטוח נגד המנה מבלי למתוח עם הצד לומן פונה כלפי מעלה ולכסות את הרקמה עם DPBS טרי. בהשוואה לעכברי נוקאאוט אפוליפופרוטאין E, קירות אבי העורקים של תאי שריר חלקים TGF-beta-R2 נוקאאוט apolipoprotein E עכברים להפגין טרשת עורקים חמורה, מה שמקשה על לנתח את הנגעים. בנוסף, המפרצות נרחבות במיוחד מתחת לאבי העורקים העל-טבעי, המזכירות מאוד מפרצות אבי העורקים האנושיות המתקדמות.
כאן, מוצגת תמונה מייצגת של אבי העורקים שלא נפתח מבעל כולסטרול גבוה, הניזון מתזונה עתירת כולסטרול TGF-beta-R2, המוכתם בעכבר אפוליפופרוטין E מוכתם בשמן אדום O. העכבר פיתח הן מפרצת עולה והן מפרצת אבי העורקים בבטן עם היווצרות נגע טרשת עורקים מואצת שנצפתה בעורקי הברכיוסקופלי, העורק הראשי, התת-בריחי, הכסלברי, הכסלאי, הירך והכליות. זה en face שמן אדום O כתמים של TGF-beta-R2 נוקאאוט apolipoprotein E רקמת עכבר חושף הגדלה מפרצת חמורה התארכות ניכרת של אבי העורקים כולו לעומת קבוצת עכבר נוקאאוט E apolipoprotein E.
חשוב להיות מסוגל להבחין שמן אדום O לוחות מוכתמים מרקע שווא שמן אדום O מוכתם רקמות שומן perivascular. לוחות טרשת עורקים הם תופעות תלת מימדיות. לאחר כימות נגע דו-ממדי אבי העורקים, אנו ממליצים על ניתוח סט פלאק כגון שורשי אבי העורקים והעורק brachiocephalic.
פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להחליט אם גורם גנטי מסוים, התערבות, או טיפול משפיע על התקדמות טרשת עורקים או רגרסיה במודלים אלה.
