يعد التحديد الكمي لآفات تصلب الشرايين في apoE وأنواع أخرى من الفئران شديدة الدهون أمرا أساسيا لتقييم العوامل الوراثية المختلفة والعلاجات الجديدة. يوفر بروتوكولنا تعليمات خطوة بخطوة لتحليل عبء تصلب الشرايين بطريقة نوعية وكمية في ماوس واحد. بعد 16 أسبوعا من تحفيز تصلب الشرايين ، قبل اختراق القلب ، قم بتحميل حقنة 10 ملليلتر مع 10 ملليلتر من DPBS وإرفاق إبرة قياس 25.
ارفع جلد البطن للفأر التجريبي باستخدام ملاقط واستخدم مقص ناعم لقطع الجلد من قاعدة البطن إلى أعلى الرقبة. افتح جدار البطن أسفل القفص الصدري واستخدم الملقط لرفع القص للوصول إلى الحجاب الحاجز. قطع الحجاب الحاجز وقطع القفص الصدري لفضح التجويف الصدري.
بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن للقلب وحقن ببطء كامل حجم DPBS في ثقب البطين الأيسر القمي. سوف يتحول لون الكبد والكلى إلى اللون البني الفاتح. عندما يتم اختراق كل المياه المالحة ، استخدم إسفنجة غير منسوجة لتنظيف تجويف الصدر من أي دم أو سائل غريب.
بعد مسح تجويف الصدر ، قم بإزالة الأعضاء غير التجريبية وقطع الترقوة باستخدام ملاقط ومقص دقيق. ضع الفأر تحت مجهر ستيريو واستخدم الملقط والمقص الربيعي لتشريح الشريان الأورطي. عندما يتم عزل الشريان الأورطي، قم بتغطية الأنسجة بإسفنجة غير منسوجة مبللة ومالحة وقم بتشريح فروع الأبهر بما في ذلك الشرايين العضدية والسباتية وتحت الكلافية والكلوية والحرقفية الشائعة والفخذية.
عندما يتم عزل جميع الشرايين المتفرعة من الشريان الأورطي ، استخدم الملقط والمقص الربيعي لتشريح وإزالة الأنسجة الدهنية والضام حول فروع الشريان الأورطي والشريان الأورطي بعناية. يتطلب العزل الناجح لفروع الشريان الأورطي والأبهر الممارسة والصبر. لإصلاح شجرة الأوعية الدموية ، قم أولا بتحميل حقنة 10 ملليلتر مع 4٪ من الفورمالديهايد في 1X DPBS وإرفاق إبرة قياس 25.
تذكر دائما إعداد 4٪ الفورمالديهايد داخل غطاء الدخان. أدخل الإبرة في ثقب البطين الأيسر القمي وحقن ببطء كامل حجم التثبيت. نظف تجويف الصدر من أي سوائل غريبة باستخدام إسفنجة غير منسوجة كما هو موضح واستخدم ملاقط ومقص زنبركي تشريحي دقيق لفصل القلب عن الشريان الأورطي.
عندما يتم فصل الأنسجة ، قم بعزل واستئصال الشريان الأورطي ووعاءه الرئيسي من ملليمتر واحد فوق الشريان السباتي إلى نهاية الشريان الفخذي ووضع الوعاء في حاوية من DPBS. لتلطيخ الزيت الأحمر O للشريان الأورطي الكامل غير المفتوح ، استخدم دبابيس Minutien لتثبيت الوعاء على طبق بتري الشمع وشطف الوعاء ب DPBS الطازج. صب 25 ملليلتر من محلول الزيت الأحمر الطازج المصفى بالمسام 0.45 ميكرومتر في الطبق للحصول على وصمة عار لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
اغمر الأنسجة بنسبة 60٪ من الأيزوبروبانول لغسلها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اشطف الوعاء ثلاث مرات بالماء المقطر العذب لمدة خمس دقائق لكل غسل وضع الطبق تحت المجهر التشريحي. استخدم الملقط والمقص الربيعي لتنظيف جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية حول الشريان الأورطي بلطف لتجنب أي خلفية زائفة تلطيخ الزيت الأحمر O ونقل الوعاء إلى شريحة مجهر زجاجية نظيفة.
سيقوم Oil Red O بتسمية البلاك الغني بالدهون باللون الأحمر ، تاركا المناطق التي لا تحتوي على البلاك شاحبة اللون. ثم الحصول على صور مجهرية رقمية عالية الدقة مع مجهر ضوئي مجهز بكاميرا وحفظ الصور ويفضل أن يكون ذلك بتنسيق ملف صورة مميز. لتركيب عينة الأنسجة الأبهرية على الوجه ، انقل الوعاء إلى طبق بتري الشمع وقم بتغطية الأنسجة ب DPBS الطازجة.
قطع الشرايين السباتية وتحت الترقوة في قوس الأبهر والشرايين الحرقفية في الشريان الأورطي البطني بعد واحد إلى مليمترين من التشعبات. قطع الشرايين الكلوية. بعد ذلك ، استخدم مقص زنبركي تشريحي دقيق لفتح إعداد الشريان الأورطي طوليا على طول الانحناء الداخلي والشرايين الحرقفية وقطع الفروع الثلاثة لقوس الأبهر على طول الانحناء الأكبر حتى المستوى الأساسي للانحناء الداخلي.
ثم استخدم دبابيس Minutien لتثبيت الشريان الأورطي مسطحا على الطبق دون التمدد مع توجيه جانب التجويف لأعلى وتغطية الأنسجة ب DPBS الطازج. بالمقارنة مع الفئران الضربة القاضية للبروتين الشحمي E ، تظهر جدران الأبهر لخلية العضلات الملساء TGF-beta-R2 الضربة القاضية الفئران الشحمية E تصلب الشرايين الشديد ، مما يجعل من الصعب تشريح الآفات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تمدد الأوعية الدموية واسع النطاق بشكل خاص أسفل الشريان الأورطي فوق الكلوي ، مما يذكرنا إلى حد كبير بتمدد الأوعية الدموية الأبهري البشري المتقدم.
هنا ، يتم عرض صورة تمثيلية للشريان الأورطي غير المفتوح من فأر عالي الكوليسترول عالي الدهون يتغذى على نظام غذائي TGF-beta-R2 بالضربة القاضية Apolipoprotein E الملطخ بالزيت الأحمر O. طور الفأر تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصاعد والبطني مع تسارع تكوين آفة تصلب الشرايين التي لوحظت في الشرايين العضدية والسباتية وتحت الكلافية والحرقفية والفخذية والكلوية. هذا في الوجه النفط الأحمر O تلطيخ TGF-بيتا-R2 بالضربة القاضية البروتين الشحمي E أنسجة الفأر يكشف عن تضخم تمدد الأوعية الدموية الشديد واستطالة ملحوظ من الشريان الأورطي بأكمله مقارنة مع البروتين الشحمي E الضربة القاضية مجموعة الفأر.
من المهم أن تكون قادرا على التمييز بين اللويحات الملطخة بالزيت الأحمر O من الخلفية الزائفة Oil Red O الأنسجة الدهنية الملطخة حول الأوعية الدموية. لويحات تصلب الشرايين هي ظواهر ثلاثية الأبعاد. بعد تحديد حجم آفة الأبهر 2D في الوجه ، نوصي بتحليل مجموعة البلاك مثل جذور الأبهر والشريان العضدي.
يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان عامل وراثي معين أو تدخل أو علاج معين يؤثر على تطور تصلب الشرايين أو تراجعه في هذه النماذج.
