ApoE ve diğer hiperlipidemik fare tiplerinde aterosklerotik lezyonların miktarının belirlenmesi, çeşitli genetik faktörlerin ve yeni tedavilerin değerlendirilmesinde anahtardır. Protokolümüz, aterosklerotik yükün tek bir farede kalitatif ve kantitatif olarak analizi için adım adım talimatlar sağlar. Aterosklerozu indükledikten 16 hafta sonra, kalbi perfüze etmeden önce, 10 mililitre DPBS ile 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve 25 gauge iğne takın.
Deneysel farenin karın derisini cımbızla kaldırın ve cildi karın tabanından boynun üstüne kadar kesmek için ince makas kullanın. Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını açın ve diyaframa erişmek için sternumu kaldırmak için cımbızı kullanın. Diyaframı kesin ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.
Daha sonra, kalbin sağ atriyumunda küçük bir kesi yapın ve DPBS'nin tüm hacmini apikal sol ventrikül ponksiyonuna yavaşça enjekte edin. Karaciğer ve böbrek açık kahverengi renge dönecektir. Tüm salin perfüze edildiğinde, herhangi bir yabancı kan ve sıvının göğüs boşluğunu temizlemek için dokunmamış bir sünger kullanın.
Göğüs boşluğu silindikten sonra, deneysel olmayan organları çıkarın ve klavikulayı cımbız ve ince makasla kesin. Fareyi stereo mikroskop altına yerleştirin ve aortu incelemek için cımbız ve yaylı makas kullanın. Aort izole edildiğinde, dokuyu salinle ıslatılmış dokunmamış bir süngerle örtün ve brakiyosefalik, karotis, subklaviyan, böbrek, ortak iliak ve femoral arterler dahil olmak üzere aort dallarını diseke edin.
Aorttan dallanan tüm arterler izole edildiğinde, aort ve aort dallarının etrafındaki adventitial yağ ve bağ dokusunu dikkatlice incelemek ve çıkarmak için cımbız ve yay makası kullanın. Aort ve aort dallarının başarılı bir şekilde izole edilmesi pratik ve sabır gerektirir. Vasküler ağacı sabitlemek için, önce 1X DPBS'de% 4 formaldehit içeren 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve 25 gauge iğne takın.
Bir duman davlumbazının içinde her zaman% 4 formaldehit hazırlamayı unutmayın. İğneyi apikal sol ventrikül ponksiyonuna yerleştirin ve tüm fiksatif hacmini yavaşça enjekte edin. Herhangi bir yabancı sıvının göğüs boşluğunu gösterildiği gibi dokunmamış bir süngerle temizleyin ve kalbi aorttan ayırmak için cımbız ve mikro diseksiyon yay makası kullanın.
Dokular ayrıldığında, aortu ve ana damarını karotis arterin bir milimetre üstünden femoral arterin sonuna kadar izole edin ve eksize edin ve damarı bir DPBS kabına yerleştirin. Açılmamış bütün aortun Yağ Kırmızısı O boyaması için, kabı bir balmumu Petri kabına sabitlemek için Minutien pimlerini kullanın ve kabı taze DPBS ile durulayın. Oda sıcaklığında 60 dakikalık bir leke için 25 mililitre taze 0,45 mikrometre gözenek filtrelenmiş Yağ Kırmızı O çözeltisini kabın içine dökün.
Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir yıkama için dokuyu% 60 izopropanol ile batırın. Kuluçkanın sonunda, kabı yıkama başına beş dakika boyunca taze damıtılmış suyla üç kez durulayın ve bulaşığı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Herhangi bir yanlış arka plan Yağ Kırmızı O lekelenmesini önlemek için aort çevresindeki tüm perivasküler yağ dokusunu nazikçe temizlemek için cımbız ve yaylı makas kullanın ve damarı temiz bir cam mikroskop slaydına aktarın.
Yağ Kırmızısı O, lipit bakımından zengin plağı kırmızı olarak etiketleyecek ve plak içermeyen alanları soluk renkte bırakacaktır. Ardından, bir kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu ile dijital yüksek çözünürlüklü mikrograflar edinin ve görüntüleri tercihen etiketli görüntü dosyası biçiminde kaydedin. Aort dokusu örneğinin en yüze montajı için, damarı bir balmumu Petri kabına aktarın ve dokuyu taze DPBS ile örtün.
Bifurkasyonlardan bir ila iki milimetre sonra aort arkının karotis ve subklaviyen arterlerini ve abdominal aorttaki iliak arterleri ayırın. Renal arterleri keser. Daha sonra, aort preparatını iç eğrilik ve iliak arterler boyunca uzunlamasına açmak için mikro diseksiyon yay makası kullanın ve aort kemerinin üç dalını iç eğriliğin taban seviyesine kadar daha büyük eğrilik boyunca kesin.
Ardından, lümen tarafı yukarı bakacak şekilde gerilmeden aortu çanağa düz bir şekilde sabitlemek için Minutien pimlerini kullanın ve dokuyu taze DPBS ile örtün. Apolipoprotein E nakavt fareleri ile karşılaştırıldığında, düz kas hücresi TGF-beta-R2 nakavt apolipoprotein E farelerinin aort duvarları, lezyonların diseksiyonunu zorlaştıran ciddi ateroskleroz gösterir. Ek olarak, anevrizmalar özellikle ileri insan aort anevrizmalarını anımsatan suprarenal aortun altında geniştir.
Burada, Yağ Kırmızı O ile boyanmış yüksek kolesterollü, yüksek yağlı diyetle beslenen TGF-beta-R2 nakavt apolipoprotein E faresinden açılmamış bir aortun temsili bir görüntüsü gösterilmektedir. Fare, brakiyosefalik, karotis, subklaviyan, iliak, femoral ve renal arterlerde gözlenen hızlandırılmış aterosklerotik lezyon oluşumu ile hem yükselen hem de abdominal aort anevrizması geliştirdi. TGF-beta-R2 nakavt apolipoprotein E fare dokusunun bu en face Oil Red O boyaması, apolipoprotein E nakavt fare grubuna kıyasla ciddi anevrizma genişlemesini ve tüm aortun belirgin uzamasını ortaya koymaktadır.
Yağ Kırmızı O lekeli plakları yanlış arka planlı Yağ Kırmızı O lekeli perivasküler yağ dokularından ayırt edebilmek önemlidir. Ateroskleroz plakları üç boyutlu olgulardır. En face aort 2D lezyon miktarından sonra aort kökleri ve brakiyosefalik arter gibi plak seti analizleri önerilmektedir.
Bu protokol, belirli bir genetik faktörün, müdahalenin veya tedavinin bu modellerde ateroskleroz ilerlemesini veya regresyonunu etkileyip etkilemediğine karar vermek için de kullanılabilir.
