המחקר שלנו מתמקד בהבנת תפקידה של מערכת העצבים בהתקדמות טרשת עורקים. באופן ספציפי, בכל אינטראקציה עם הרכס, אנו שואפים לענות על האופן שבו העצב משתנה במהלך טרשת עורקים וכיצד האינטראקציה שלו משפיעה על התקדמות המחלה. מספר טכנולוגיות מתקדמות משמשות כיום לקידום מחקר טרשת עורקים כדי לשפר את ההבנה של מנגנוני מחלה.
אלה כוללים ניקוי רקמות והדמיה תלת מימדית, טכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות, בינה מלאכותית, ריצוף תאים בודדים ולמידת מכונה. במהלך התקדמות טרשת עורקים, רכיבי דופן העורקים עוברים ארגון מחדש חזק. תיחום השינויים בהדמיה תלת מימדית וברזולוציה גבוהה של הרקמות השלמות הם אתגרי הניסוי המרכזיים.
כלי ההדמיה המתוארים כאן יסייעו לחוקרים ולקרדיולוגים להבין טוב יותר את המחלה ובסופו של דבר לסייע בטיפול בחולים. הפרוטוקול המתואר כאן מציע מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות כגון הדמיית רקמות עמוקות של הרקמות השלמות, כמו גם הדמיה של המבנה שלהן שאחרת אינן נגישות. פרוטוקולים אלה יעזרו להבין טוב יותר את האינטראקציה בין תא לתא-רקמה כדי לשפר את ההבנה של התקדמות המחלה.
הדמיית השינויים התאיים והמבניים בתלת מימד ברקמה השלמה יכולה לספק תובנה חדשה להבנה טובה יותר של השאלות הביולוגיות הבלתי פתורות במחקר הלב וכלי הדם. כדי להתחיל, הניחו את העכבר המורדם על צלחת קצף מכוסה במגבות נייר כירורגיות. קבע את זרועותיו ורגליו של העכבר במצב שכיבה באמצעות סרטי דבק.
לחטא את החזה עם אתנול 75%. אוספים את הדם מהחדר השמאלי באמצעות מזרק חד פעמי של מיליליטר אחד. לאחר מכן בצע חתך בקו האמצע בחזה וחתך קטן בפרוזדור הימני.
יש להחדיר את החדר השמאלי של העכבר ב-10 מיליליטר של EDTA של חמישה מילי-מולרים ב-PBS למשך חמש דקות עד שהדם נשטף החוצה, ולאחר מכן 20 מיליליטר של PBS למשך 5 עד 10 דקות. לבסוף, יש להחדיר עם 10 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, הסר את האיברים הפנימיים, כולל איברי מערכת העיכול והרבייה.
השאירו את הלב, אבי העורקים והכליות שלמים. לאחר מכן הסר בזהירות את בלוטת התימוס ואת רקמת השומן שמסביב. חשוף את כל אבי העורקים מאבי העורקים העולה להתפצלות הכסל.
קצרו את כל אבי העורקים, והניחו אותו בצלחת פטרי מלאה ב-PBS. הפרד את אבי העורקים למקטעים שונים ופצל אותו לאורך לשני ניקוי 2, 2'Thiodiethanol או TDE. הצמידו את אבי העורקים הקצה על צלחת שעווה שחורה שטוחה בצורת Y, וקבעו אותה ב-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, שחררו את אבי העורקים והעבירו אותו ל-PBS לשטיפה של חמש דקות. לאחר מכן העבירו את אבי העורקים לתמיסת חסימה למשך שעתיים לחסימה וחדירה. לאחר מכן, דגרו על אבי העורקים עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה למשך 24 שעות.
שטפו את אבי העורקים ב-PBS במשך חמש דקות, חזרו על הפעולה חמש פעמים לפני הדגירה עם נוגדנים משניים בסרום חמור רגיל של 10% ו-DAPI לצביעה גרעינית למשך הלילה, העבירו את אבי העורקים המוכתם לריכוז הולך וגדל של תמיסת TDE. לאחר מכן, הדביקו היטב את מרווח ההדמיה המלבני הדביק הדו-צדדי למגלשת זכוכית נקייה והעבירו את אבי העורקים הנקי, תוך הקפדה על הרפתקאות אבי העורקים של פני הקצה פונה להחלקת הכיסוי. הרכיבו את אבי העורקים בטיפות של תמיסת TDE 60% והצמידו בזהירות תלוש כיסוי לבאר תוך הימנעות מבועות אוויר.
הפעל את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ההפוך המצויד במטרת טבילת שמן פי 20. כוונן את גלאי הדיודות ההיברידיות על סמך צבעי הכתם. התאם את הגדרות התצוגה ובחר בפורמט XY של 1024x1024 פיקסלים להדמיה.
זרוק שמן טבילה על החלקת הכיסוי והזיז את המטרה פי 63 בגסות לכיוון הדגימה עד שהיא נוגעת בשמן הטבילה ובהחלקת הכיסוי. לאחר מכן זהה את אזור העניין ורכוש ערימות Z מהצד האדוונטיטי של אבי העורקים הקצה בגודל צעד של שניים עד ארבעה מיקרומטר עד לעומק של 60 מיקרומטר להדמיה תלת מימדית. תן שם לקובץ עם פרטים לדוגמה ופרטי סריקה ושמור את הנתונים.
באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני זקוף המצויד במטרה של פי 20, רכשו ערימות Z מהצד האלומינלי בגודל צעד של 10 עד 15 מיקרומטר עד לעומק של 700 מיקרומטר. לאחר הרדמה והחדרה של העכבר עם PBS ופרפורמלדהיד, נתח את חלק הגוף מעל רמת הסרעפת. יש לתקן את החלק התחתון של פלג הגוף עם 4% פרפורמלדהיד למשך יום עד יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, יש לשטוף היטב את הדגימה ב- PBS למשך 10 דקות, ולחזור על הפעולה שלוש פעמים. דגרו את הדגימה בתמיסה של 20% מעוקב למשך 48 שעות. לאחר שטיפה עם PBS, דגרו את הדגימה בתמיסת PGST למשך הלילה לחדירה וחסימה.
למחרת, דגרו את הדגימה עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת PGST בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 10 עד 12 ימים. לאחר שטיפת הדגימה ב-PGST, הוסף נוגדנים משניים ב-DAPI ב-PGST בארבע מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים. שטפו היטב את הדגימה ב-PGST למשך שעה, וחזרו על עצמן חמש פעמים.
להעביר את הדגימה המוכתמת לסדרה של ריכוזים מוגברים של תמיסות עבודה טטרהידרופורן להתייבשות, תוך דגירה של 12 שעות לריכוז. לאחר התייבשות, הניחו את הדגימה בתמיסת דיכלורומתאן מוחלטת למשך שלוש שעות להסרת שומנים. לאחר מכן, דגרו את הדגימה במקדם שבירה התואם תמיסת בנזיל אלכוהול בנזיל בנזואט למשך שלוש עד שש שעות.
כדי להתחיל, טען את התמונות המרוצפות בערימת Z של תמונות אבי העורקים של העכבר וחלקי פלג הגוף התחתון לתחנת העבודה לעיבוד התמונה. כדי לקודד בצבע את עומק הנפח של תא או מבנה, השתמש בתוכנת שחזור תמונה כדי לבטל את הפיתול של התמונה הגולמית. בתוכנת פיג'י, צור הקרנה בעוצמה מקסימלית של הנתונים המפותלים באמצעות קידוד צבע זמני.
טען את סדרת תמונות ה-TIFF באריחי Z לתוכנה. באמצעות תוסף התפירה של פיג'י, תפר את התמונות ושמור אותן בפורמט TIFF. לאחר מכן, טען את התמונות התפורות לתוכנת הדמיה תלת מימדית לפילוח תמונה.
עקוב ידנית אחר המבנים העצביים בציר XYZ לאורך כל הנתיב בין אבי העורקים לגרעיניה. טען תמונות מעובדות מראש לתוכנת ניתוח תמונות. השתמש באוטופלואורסצנציה כדי לפלח את אבי העורקים ורקמות החיבור.
החל פסאודו-צבעים נפרדים כדי לדמיין את דופן אבי העורקים והפלאק הייחודיים. לבסוף, השתמש בפונקציית השוואת ההיסטוגרמה האדפטיבית המוגבלת בניגודיות כדי לשפר את הניגודיות המקומית על רקע התמונות המעובדות. אבי העורקים הטרשת TDE חשף תאי T מוכתמים CD3e בפלאק, ניאוגנזה נרחבת של סיבי עצב מוכתמים NF200 באיברי לימפה שלישוניים עורקיים.
הדמיה מרובת פוטונים של אבי העורקים הבטני החולה בעכברי נוקאאוט APOE הראתה נביטת אקסון המבטא NF200 באזורים חסרי תאי B חיוביים B220 בתוך איברי הלימפה השלישוניים העורקיים. הדמיית יריעות אור של בטן עכבר מנוקה על ידי iDISCO הדמתה את הקשר המרחבי בין אבי העורקים לגרעינים סימפתטיים עם אקסונים מוכתמים NF200 שנוצרו לאחרונה על האדוונטיציה הסמוכה לרובד טרשת עורקים.
