La cuantificación de las lesiones ateroscleróticas en apoE y otros tipos de ratones hiperlipidémicos es clave para la evaluación de diversos factores genéticos y nuevas terapias. Nuestro protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el análisis de la carga aterosclerótica de manera cualitativa y cuantitativa en un solo ratón. 16 semanas después de inducir la aterosclerosis, antes de perfundir el corazón, cargue una jeringa de 10 mililitros con 10 mililitros de DPBS y conecte una aguja de calibre 25.
Levante la piel abdominal del ratón experimental con pinzas y use tijeras finas para cortar la piel desde la base del abdomen hasta la parte superior del cuello. Abra la pared abdominal debajo de la caja torácica y use las pinzas para levantar el esternón para acceder al diafragma. Corte el diafragma y corte la caja torácica para exponer la cavidad torácica.
A continuación, haga una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón e inyecte lentamente todo el volumen de DPBS en la punción ventricular izquierda apical. El hígado y el riñón se volverán de color marrón claro. Cuando toda la solución salina haya sido perfundida, use una esponja no tejida para limpiar la cavidad torácica de cualquier sangre y líquido extraños.
Después de limpiar la cavidad torácica, retire los órganos no experimentales y corte la clavícula con pinzas y tijeras finas. Coloque el ratón debajo de un microscopio estereoscópico y use las pinzas y las tijeras de resorte para diseccionar la aorta. Cuando la aorta haya sido aislada, cubra el tejido con una esponja no tejida empapada de solución salina y diseccione las ramas aórticas, incluidas las arterias braquiocefálica, carótida, subclavia, renal, ilíaca común y femoral.
Cuando se hayan aislado todas las arterias que se ramifican desde la aorta, use pinzas y tijeras de resorte para diseccionar y eliminar cuidadosamente el tejido adiposo y conectivo adventicio alrededor de las ramas de la aorta y la aorta. Un aislamiento exitoso de las ramas aorta y aórtica requiere práctica y paciencia. Para fijar el árbol vascular, primero cargue una jeringa de 10 mililitros con 4% de formaldehído en 1X DPBS y conecte una aguja de calibre 25.
Recuerde preparar siempre un 4% de formaldehído dentro de una campana extractora de humos. Inserte la aguja en la punción ventricular izquierda apical e inyecte lentamente todo el volumen de fijador. Limpie la cavidad torácica de cualquier líquido extraño con una esponja no tejida como se ha demostrado y use pinzas y tijeras de resorte microdisecantes para separar el corazón de la aorta.
Cuando los tejidos se han separado, aísle y extirpe la aorta y su vaso principal desde un milímetro por encima de la arteria carótida hasta el final de la arteria femoral y coloque el vaso en un recipiente de DPBS. Para la tinción Oil Red O de la aorta entera sin abrir, use alfileres Minutien para asegurar el recipiente en una placa de Petri de cera y enjuague el recipiente con DPBS fresco. Vierta 25 mililitros de solución fresca de Oil Red O filtrada por poro de 0,45 micrómetros en el plato para una tinción de 60 minutos a temperatura ambiente.
Sumerja el tejido con 60% de isopropanol durante un lavado de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, enjuague el recipiente tres veces con agua destilada fresca durante cinco minutos por lavado y coloque el plato bajo el microscopio de disección. Use pinzas y tijeras de resorte para limpiar suavemente todo el tejido adiposo perivascular alrededor de la aorta para evitar cualquier tinción de fondo falso oil red O y transfiera el vaso a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio.
Oil Red O etiquetará la placa rica en lípidos de color rojo, dejando las áreas que no contienen placa de color pálido. Luego adquiera micrografías digitales de alta resolución con un microscopio de luz equipado con una cámara y guarde las imágenes preferiblemente en formato de archivo de imagen etiquetada. Para el montaje facial de la muestra de tejido aórtico, transfiera el vaso a una placa de Petri de cera y cubra el tejido con DPBS fresco.
Cortar las arterias carótidas y subclavias del arco aórtico y las arterias ilíacas en la aorta abdominal uno o dos milímetros después de las bifurcaciones. Cortar las arterias renales. A continuación, use tijeras de resorte de microdisección para abrir longitudinalmente la preparación de la aorta a lo largo de la curvatura interna y las arterias ilíacas y corte las tres ramas del arco aórtico a lo largo de la curvatura mayor hasta el nivel de base de la curvatura interna.
Luego use alfileres Minutien para asegurar la aorta plana contra el plato sin estirarse con el lado del lumen hacia arriba y cubra el tejido con DPBS fresco. En comparación con los ratones knockout de apolipoproteína E, las paredes aórticas de los ratones de apolipoproteína E knockout TGF-beta-R2 de células musculares lisas demuestran aterosclerosis severa, lo que dificulta la disección de las lesiones. Además, los aneurismas son particularmente extensos por debajo de la aorta suprarrenal, lo que recuerda mucho a los aneurismas aórticos humanos avanzados.
Aquí, se muestra una imagen representativa de una aorta sin abrir de un ratón de apolipoproteína E alimentado con TGF-beta-R2 alimentado con dieta alta en grasas teñido con Oil Red O. El ratón desarrolló un aneurisma aórtico ascendente y abdominal con formación acelerada de lesiones ateroscleróticas observadas en las arterias braquiocefálica, carótida, subclavia, ilíaca, femoral y renal. Esta tinción cara Oil Red O del tejido de ratón de la apolipoproteína E knockout TGF-beta-R2 revela un agrandamiento grave del aneurisma y un marcado alargamiento de toda la aorta en comparación con el grupo de ratones knockout de apolipoproteína E.
Es importante poder distinguir las placas teñidas de Oil Red O de los tejidos adiposos perivasculares teñidos de Oil Red O de fondo falso. Las placas de aterosclerosis son fenómenos tridimensionales. Después de la cuantificación de la lesión aórtica 2D en la cara, recomendamos el análisis del conjunto de placas, como las raíces aórticas y la arteria braquiocefálica.
Este protocolo también se puede utilizar para decidir si un factor genético, intervención o tratamiento en particular afecta la progresión o regresión de la aterosclerosis en estos modelos.
