המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה (KAUST).

אזהרה: יש להיוועץ תמיד בכל גיליונות נתוני בטיחות החומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים ובציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות). בצע את כל התגובות הביולוגיות במכסה האדים הביולוגי.
הערה: פרוטוקול זה מיועד לייצר 2 x 10 10 NWs/mL ביו-פונקציונליים שווה ערך ל-0.36 מ"ג ברזל/מ"ל המצופים בנוגדנים נגד CD44 עם צפיפות של 3 x10 4 נוגדנים/NW. תחמוצת ברזל-ברזל (מעטפת הליבה) NW הם באורך 2.5 מיקרומטר ויש להם קוטר של 41.5 ננומטר.
1. שחרור ננו-חוטי ברזל
הערה: תהליך הייצור של תחמוצת ברזל / תחמוצת ברזל NW הוסבר בפירוט בפרסום קודם59.
<ol><li>על משטח חיתוך, חתכו את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) באמצעות להב קצה יחיד ופטיש קטן כדי להתאים לצינור של 2 מ"ל. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את חתיכות האל הקטנות לצינור.</li>
	<li>מלאו את צינור 2 מ"ל, המכיל את חתיכות Al הקטנות, עם 1 מ"ל של 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH). ודא שכל חתיכות Al מכוסות ב- NaOH.</li>
	<li>השאירו את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה אדים כימי.</li>
	<li>הסירו רק את חתיכות ה-Al באמצעות הפינצטה ושמרו את ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) ששוחררו בתמיסת NaOH למשך 30 דקות נוספות. אל תשנה את פתרון NaOH.</li>
	<li>אספו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף מגנטי והמתינו 2 דקות לפני הסרת תמיסת ה-NaOH הישנה בנפח 1 מ"ל. החלף אותו בתמיסת NaOH טרייה.</li>
	<li>סוניק את צינור 2 מ"ל המכיל את NWs במשך 30 שניות ולהשאיר אותו 1 שעה בתוך מכסה אדים כימי.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.5-1.6 לפחות ארבע פעמים.</li>
	<li>שטפו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.</li>
	<li>השליכו את תמיסת NaOH והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט.</li>
	<li>סוניק את הצינור למשך 30 שניות.</li>
	<li>הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.</li>
	<li>השליכו את תמיסת האתנול האבסולוטית הישנה והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 30 שניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.11 ו- 1.12 לפחות ארבע פעמים.</li>
	<li>שמור את NWs ב 1 מ"ל של אתנול מוחלט בטמפרטורת החדר עד שהם נחוצים.</li>
	<li>למדוד את ריכוז הברזל ומכאן את NWs באמצעות ספקטרומטריית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עם זאת, עבור אחסון לאורך זמן, אל תשחרר את NWs מתבנית Al עד שיהיה צורך. שמירה על NW משוחרר מזרז אתנול במשך זמן רב ללא סוניקציה תכופה תיצור צברים כי יהיה צורך פעמים ארוכות יותר של סוניקציה כדי להיות מופרד.</li>
</ol>2. ציפוי הננו-חוטים ב-APTES
הערה: בפרוטוקול זה, 100 μL של תמיסת APTES (צפיפות של 0.946 גרם/מ"ל61) מספיקים כדי לצפות 1.6 x 107 מ'2/g של NWs. אם יש שינוי ביחס או במסה של הננו-חומר, יש להתאים את נפח APTES בהתאם.
<ol><li>העבר את NWs משלב 1.14 לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>כדי לאסוף את כל NWs שנותרו בצינור 2 מ"ל, לשטוף את הצינור הריק 2 מ"ל פעמיים על ידי הוספת 1 מ"ל של אתנול מוחלט ולהעביר אותו לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>באמצעות פיפטה, לקחת 100 μL של APTES ולהוסיף אותו לפתרון NW ישירות.</li>
	<li>מערבול את צינור הזכוכית 5 מ"ל במשך 10 שניות.</li>
	<li>כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל על המהדק של מעמד תגובה במעבדה.</li>
	<li>מניחים מחצית מצינור הזכוכית 5 מ"ל בתוך המים של האמבטיה העל-קולית וסוניקטים למשך שעה אחת.</li>
	<li>הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה העל-קולית והוסיפו 400 מיקרוליטר מים דה-יוניים (DI) ואחריו 20 מיקרוליטר של 1 M NaOH (קטליזה בסיסית). זהירות: חשוב להוסיף תחילה את מי DI.</li>
	<li>כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל, כפי שמוסבר בשלבים 2.5-2.6, וסוניקט למשך שעה נוספת.</li>
	<li>הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה הקולית.</li>
	<li>הניחו מגנט ליד צינור הזכוכית למשך 5 דקות כדי לאסוף את ה- NWs.</li>
	<li>החליפו את הסופרנאטנט ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 10 שניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.10-2.11 ארבע פעמים.</li>
	<li>העבר את כל האתנול המרחף NW לצינור זכוכית חדש של 5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את NW מצופה APTES בשפופרת זכוכית עם אתנול עד שהם נחוצים. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>3. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים
<ol><li>הפעלת הנוגדנים הערה: כדי להשיג כ-3 x 104 חלקים של נוגדן/NW, יש להשתמש ב-30 מיקרוליטר של נוגדן (1 מ"ג/מ"ל) לכל 0.1 מ"ג ברזל.<ol><li>בצינור של 2 מ"ל, יש להמיס 0.4 מ"ג של 3-3-דימתיל-אמינופרופיל קרבודימיד (EDC) ו-1.1 מ"ג של סולפו-N-הידרוקסי-סולפוסוקסינימיד (Sulfo-NHS) ב-1 מ"ל של הידרט חומצה אתנסולפונית 2-N-מורפולינו (MES) (pH 4.7). הערה: תערובת EDC/sulfo-NHS צריכה להיות טרייה ומוכנה לפני השימוש.</li>
		<li>בצינור חדש של 2 מ"ל, הוסף 30 μL של נוגדן נגד CD44 (1 מ"ג / מ"ל), 960 μL של 0.1 M של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7), ו 10 μL של תערובת EDC / sulfo-NHS (מוכן בשלב 3.1.1), בהתאמה.</li>
		<li>הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל בשייקר צינור בגודל 10 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת ננו-חוטים מצופים APTES<ol><li>במהלך הדגירה בת 15 הדקות בשלב 3.1.3, שטפו את ה-NWs על ידי הצבת מגנט ליד צינור ה-NWs המצופה APTES (משלב 2.13) למשך 2 דקות כדי לאסוף את ה-NWs.</li>
		<li>השליכו את האתנול והחליפו אותו ב-1 מ"ל של 0.1 מ"ל PBS (pH 7), ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשך 10 שניות.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.1-3.2.2 ארבע פעמים.</li>
		<li>אסוף את ה- NWs, כפי שמוסבר בשלב 3.2.1, והשלך את PBS 0.1 M. שמור את NWs בצינור ללא כל פתרון.</li>
	</ol></li>
	<li>התקשרות הנוגדנים<ol><li>העבר את כל תמיסת הנוגדנים המופעלת (שהוכנה בשלב 3.1.3) לצינור NWs (מוכן ב- 3.2.4) וסוניקט למשך 10 שניות.</li>
		<li>הניחו את צינור הזכוכית במסובב למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>אספו את ה-NWs באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והשליכו את הסופר-נטנט.</li>
		<li>הוספת 1 מ"ל של תמיסת אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) למשך שעה אחת ב-4°C כדי לחסום את התגובה.</li>
		<li>בדוק את האנטיגניות של NW פונקציונלי נוגדנים, למשל, באמצעות immunoprecipitation (IP) ו כתם מערבי (WB) assays. הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, השתמש ב- NW הפונקציונלי ביולוגית בבדיקת IP, WB או תאימות ביולוגית מיד לאחר שלב החסימה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. בדיקת תאימות ביולוגית
הערה: כדי לחקור את התאימות הביולוגית של NWs, ניתן להשתמש במבחני כדאיות תאים שונים ובקווי תאים שונים. ריכוז ה-NWs המשמשים כאן מבוסס על פרסום קודם16. זריעת התאים צריכה להיעשות יום אחד לפני התפקוד הביולוגי של NW.
זהירות: כל השלבים הבאים צריכים להיעשות תחת ארון הבטיחות הביולוגית.
<ol><li>בצלחת של 96 בארות, זרעו תשע בארות עם 4 x 104 של תאי סרטן המעי הגס (קו תאי HCT116) מרחפים במדיה של תרבית תאים של McCoy (100 μL / באר) ומניחים אותו בתוך האינקובטור למשך הלילה ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).</li>
	<li>שטפו את ה-NWs (משלב 3.3.4) עם PBS על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחלף את התמיסה הישנה ב-1 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7). חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>שטפו את ה-NWs (משלב 4.2) עם המדיה המחוממת של McCoy על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחליפו את PBS הישן ב-1 מ"ל של מדיה מחוממת של McCoy. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>איסוף NWs (משלב 4.3) באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 ולהחליף את 1 מ"ל של מדיה מחוממת McCoy עם 900 μL של מדיה מחוממת McCoy. ריכוז NWs צריך להיות 0.02 מ"ג של NWs לכל מ"ל.</li>
	<li>קח את צלחת 96 בארות (משלב 4.1) מן האינקובטור אל ארון הבטיחות הביולוגית.</li>
	<li>מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, השליכו את המדיה הישנה מהתאים והחליפו אותה ב-100 מיקרוליטר של NW מרחף (שהוכן בשלב 4.4).</li>
	<li>נערו את הצלחת (שהוכנה בשלב 4.6) ביד ולאחר מכן דגרו עליה במשך 24 שעות בתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
	<li>למחרת, הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.7) מהאינקובטור. תחת ארון הבטיחות הביולוגית, הוסף 11 μL של מגיב כדאיות התא (טבלה של חומרים) לכל באר באמצעות פיפטה מרובת דפנות.</li>
	<li>נערו את הצלחת עם שייקר הצלחת במהירות של 10 x גרם במשך 10 שניות.</li>
	<li>דוגרים על הצלחת במשך שעה באינקובטור.</li>
	<li>הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.10) מהאינקובטור. קרא את הלוח בקורא המיקרו-צלחות (רשימת חומרים) על-ידי מדידת הספיגה של מגיב הכדאיות של התא (עירור 540 ננומטר, פליטה 590 ננומטר).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כמו בכל שיטת ייצור וציפוי ננו-חומרים, נדרשת איכות גבוהה של הפתרונות המשמשים. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרונות השחרור (1 M NaOH) והפונקציונליות (MES) מספר פעמים. עם זאת, בדיקת ערך ה- pH שלהם לפני תחילת תהליך חדש חשובה מאוד. בשלב השחרור, שטיפת NWs עם NaOH צריך להתבצע לפחות ארבע פעמים. ככל שהכביסה טובה יותר, כך יציבות ה-NW טובה יותר ופחות הם מצטברים. שכבת התחמוצת משפרת את יציבות ה-NWs בעת טבילה באתנול או במים63.
הקוטר והאורך של ה-NW הושפעו לאחר שציפויים אותם ב-APTES ובנוגדנים. כאן, הקוטר גדל מ 41.5 ננומטר ל 70 ננומטר, ואת האורך ירד מ 2.5 מיקרומטר ל 1.6 מיקרומטר, בשל שלבי סוניקציה לשבור NWs. לכן, חיוני לאפיין את המורפולוגיה של NWs לאחר שלב biofunctionalization.
החיבור של הנוגדנים ל- NWs מסתמך על האינטראקציה הקוולנטית בין קבוצת האמין (על APTES) לבין קבוצת הקרבוקסיל (על הנוגדן). לכן, אישור נוכחותו של ציפוי APTES הוא צעד חשוב, שעבורו השתמשנו במיפוי EELS. שיטת הציפוי בטוחה ופשוטה. זה לא צריך טמפרטורות גבוהות או זמני דגירה ארוכים. כמו כן, ציפוי APTES פועל כמקשר כדי לאפשר התקשרות קוולנטית של נוגדנים או חלבונים אחרים שיש להם קבוצת קרבוקסיל.
במקרה של תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדן, האנטיגניות של אתרי הקישור של הנוגדנים לאחר תהליך biofunctionalization יכול להיות מושפע. ניתן להשתמש בשיטת IP ו- WB כדי לחקור בעיה זו. שימוש בשיטת הביו-פונקציונליזציה המוזכרת בפרוטוקול זה יאפשר לנוגדנים להיקשר ל-NWs עם אנטיגניות גבוהה לקולטן תא מסוים. יתר על כן, תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדנים הוסיף את היכולת לכוון את התאים עם קולטן של עניין, CD44 כאן. זה אושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. למרות שהתאימות הביולוגית של NWs לא מצופים הייתה גבוהה (>95%), הוספת ציפוי APTES או נוגדנים ל- NWs שיפרה את התאימות הביולוגית שלהם ב- 100%.
יתר על כן, פרוטוקול הציפוי והביו-פונקציונליזציה יעיל, חסכוני וניתן לשחזור. זה צריך להיות ישים לכל ננו-חומר תחמוצת ברזל אחר, שבו ריכוז הציפוי והנוגדנים המחוברים צריך להיות אופטימלי בהתבסס על שטח הפנים והמסה של הננו-חומר. פרוטוקול זה יכול להיעשות בבטחה בתנאי הסביבה במעבדה הכללית. הביו-פונקציונליזציה שיפרה באופן משמעותי את התאימות הביולוגית של הננו-חומר ואת יכולת המיקוד שלו. באופן כללי, NWs הם חומרים מבטיחים ביותר עבור יישומים ננו-רפואיים (כולל טיפולים רב-מודאליים או קומבינטוריים, זיהוי או הנחיה של תאים, וחישה ביולוגית). בשילוב עם ביו-פונקציונליזציה, כפי שמתואר כאן, ניתן להשיג מיקוד תאים ספציפי לשיפור הדיוק והיעילות.

תכונה ייחודית של ננו-חומרים מגנטיים היא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים1, אשר ניתן לנצל לתועלת כדי להפעיל אותם בדרכים רבות , בעוד שהם יכולים גם להיות מנוטר, למשל, על ידי דימות תהודה מגנטית (MRI). בעת החלת שדה מגנטי לסירוגין בתדר גבוה, הם יכולים ליצור חום, אשר יכול לגרום היפרתרמיה, מתן אפשרות טיפולית1. גישה נוספת היא טיפול פוטותרמי, אותו ניתן לממש באמצעות לייזר אינפרא אדום קרוב (NIR) 2,3.
בין המספר הגדול של ננו-חומרים מגנטיים, תחמוצת ברזל קיבלה את תשומת הלב הגדולה ביותר ביישומים ביולוגיים כגון הפרדה מגנטית, היפרתרמיה2,4, הנחיית תאים5, אספקת תרופות 6,7,8, וכחומר ניגוד ב- MRI 9,10. זאת בשל תאימות ביולוגית גבוהה שלהם 11,12, מגנטיזציה גדולה 11,12, יכולת להיות מצופה 9,13,14,15, יכולת לשאת תרופות 2,16, יכולת לתפקד עם תרופות2,16 או/ו סוכני מיקוד12,13,17,18, ויכולת להמיר אנרגיה אופטית לחום2. לאחרונה, MagForce החלה בניסויים קליניים בחולי סרטן המשתמשים בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל לטיפול בהיפרתרמיה19.
לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) מנוצלים יותר ויותר ליישומים ביו-רפואיים 3,11,16,20,21,22. יש להם תכונות דומות לננו-חרוזים מגנטיים, אך הם מציעים צורה אנאיזוטרופית ומומנט מגנטי גדול מאוד, המאפשר שליטה מרחוק יעילה מאוד על ידי שדה מגנטי23,24, כולל הפעלה בתדר נמוך כדי לגרום לאפקטים מגנטו-מכניים 25,26,27,28,29. כתוצאה מכך, NWs יושמו עבור יישומים ביולוגיים שונים כגון בידוד אקסוזומים30 מעקב אחר תאים 21, טיפול בסרטן 3,11,16, אספקת תרופות 16,31,32, וכחומר ניגוד MRI 33.
ננו-חומרים מגנטיים ביו-פונקציונליים בעלי יכולת מיקוד תאים ספציפית הם בעלי פוטנציאל גדול ליישומים ביו-רפואיים וברפואה מדויקת34,35. כדי לחבר את סוכני המיקוד הללו, נדרש שינוי פני השטח של הננו-חומרים. בדרך כלל, הם זקוקים לציפוי המספק קבוצה פונקציונלית, המאפשרת את החיבור של הסוכנים המטפלים. בספרות, יש מספר רב של ציפויים אורגניים ואי-אורגניים עבור ננו-חומרים מגנטיים. בהתבסס על הקבוצה הפונקציונלית שניתן לשתק לננו-חומר, ניתן לסווג ציפויים אלה לארבע קבוצות עיקריות: מולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית, פולימרים, היסטידין ומולקולות המבוססות על קבוצות סילאן.
המולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית היא אחת משיטות שינוי פני השטח. הוא מנצל את האהדה הגבוהה בין קבוצת החומצה הקרבוקסילית השלילית על הציפוי לבין המטען החיובי על הננו-חומרים המגנטיים36,37,38. תהליך הקשירה של חומצה קרבוקסילית למשטח מתכת עשוי לכלול יצירה של מלחי מתכת-קרבוקסילט או היצמדות של קבוצת הקרבוקסיל למתכת. עם זאת, עבור NW רב-מקטעים, כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs, שיש להם תכונות מעולות עבור יישומים ביולוגיים39,40, סוג זה של ציפוי לא יכול להיות מיושם בקלות. הוא דורש שני ציפויים שונים בו זמנית: קבוצות תיול לשינוי מקטעי הזהב וקבוצות קרבוקסיל למקטעים מגנטיים (ברזל או ניקל)38. כמה דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות קרבוקסיל הן המטופורפירין, חומצה פימלית, חומצה פלמיטית, וחומצה פרופיונית 3-[(2-אמינואתיל) דיתיו] (AEDP)38. שינויים בפני השטח של ננו-חומרים מגנטיים באמצעות פולימרים מציעים כמה יתרונות ברורים. בשל המשקל המולקולרי הגדול של הפולימרים, הוא משפר את יציבות הננו-חומר המגנטי בתמיסה38. עם זאת, זה יגדיל באופן משמעותי את גודל ננו-חומר38. פוליוויניל פירולידון (PVP), פוליאתילנימין (PEI), חומצה אספרטית ארגינין-גליצין-D (RGD) ופוליאתילן גליקול (PEG) הם כמה דוגמאות לפולימרים הנפוצים ביותר לשינויים בפני שטח. לכל אחד מהם תכונות משלו ומשתמשב-38. שיטת שינוי פני השטח השלישית היא באמצעות ציפוי היסטידין. היסטידין הוא חלבון בעל שרשרת צדדית של חומצות אמינו היסטידין בעל זיקה גבוהה למספר מוגבל של ננו-חומרים מגנטיים כגון ניקל38. ניתן להשתמש בו לתהליכי טיהור חלבונים 38,41,42. ציפוי היסטידין יכול להיות מיושם גם על NW רב-מקטעים, כגון ניקל/זהב NWs38. סילניזציה של משטח ננו-חומר היא תהליך מבוסס היטב 38,43,44. הוא מבוסס על אטום סיליקון המקושר לכל משטח תחמוצת מתכת באמצעות שלושה קשרים בודדים, ובמקביל אטום סיליקון זה נקשר לקבוצה הפונקציונלית בסוף דרך שרשרת אלקיל 38,43,44. היתרון של ציפוי זה הוא מתן קבוצות אמין חופשיות, ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים38,45, כגון ניקל וזהב, בהתאמה. לכן, שימוש במולקולות המבוססות על קבוצת המלח הוא מסלול מעשי לביו-פונקציונליזציה של NW רב-מקטעים. דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות סילאן הן (3-aminopropyl), triethoxysilane (APTES) ו-(3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS)38,45.
הוספת חומר מיקוד לציפוי יכולה למלא תפקיד משמעותי הן באבחון והן בטיפול בתאים חולים, ובמקביל למזער את תופעות הלוואי על רקמות בריאות46,47. הוספת חומר מיקוד על פני השטח של ננו-חומרים משפרת הן את הקישור הסלקטיבי התאי והן את ההפנמה באמצעות קולטני אנדוציטוזה7. ללא ליגנדות מטרה אלה, ננו-חומרים מתקשרים באופן לא ספציפי עם קרום התא, אשר נקשר בקצב נמוך יותר בהשוואה לננו-חומרים עם ליגנדות48. אחד האתגרים במיקוד רקמות סרטניות הוא הדמיון האופייני שלהן לרקמות בריאות. לכן, הצלחת המיקוד תלויה בעיקר בקביעת הליגנד המתאים לשימוש כמטרה ביולוגית49,50. סוכני מיקוד שונים שימשו כדי לכוון ננו-חומרים לתאי סרטן48,51 (למשל, CD44, בשל הביטוי הגבוה שלו בתאי סרטן בהשוואה לתאים בריאים52,53,54,55).
ניתן לסווג את סוכני המיקוד לשלוש קבוצות עיקריות, בהתבסס על המרכיבים מהם הם עשויים ומורכבותם: מיקוד מבוסס אפטמר, מיקוד מבוסס ליגנד ומיקוד מבוסס נוגדנים. Aptamers הם גדילים קצרים מסונתזים כימית של DNA או RNA-oligonucleotides המקופלים למבנים דו ותלת ממדיים, מה שהופך אותם מסוגלים להתמקד אנטיגן מסוים, לרוב חלבונים56. מיקוד מבוסס ליגנד כולל פפטידים ושרשראות חומצות אמינו קצרות57. מיקוד מבוסס נוגדנים כרוך בשימוש בנוגדן שלם, או במקטעי נוגדנים, כגון מקטעים משתנים בעלי שרשרת אחת או מקטעים קושרי אנטיגן51. לשימוש בשיטה זו יש יתרון בכך שיש לו שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה לאנטיגן המטרה הספציפי שלו, מה שמקנה לו סלקטיביות גבוהה ביותר58. אתרי הקשירה מקבילים למנעול והאנטיגן למפתח58.
בעבודה זו, NWs בשימוש יוצרו על ידי אלקטרודפוזיציה על ממברנות תחמוצת אלומיניום, שיטה שתוארה בפירוט בפרסום קודם59. ההתמקדות כאן היא בשחרור NW אלה של תחמוצת ברזל-ברזל (קליפת הליבה) מהממברנות ותפקודם הביולוגי עם נוגדנים ספציפיים כדי לספק יכולת מיקוד. הנוגדנים אינם יכולים להיקשר ישירות לתחמוצת הברזל-ברזל NWs ודורשים מקשר. ציפוי ה-NWs ב-APTES מספק קבוצות אמין חופשיות, מה שמאפשר את ההתקשרות הקוולנטית דרך קבוצת הקרבוקסיל על הנוגדנים (איור 1). היתרון של ציפוי APTES הוא היכולת שלו לעבוד הן עבור חומרים מגנטיים21 והן עבור חומרים לא מגנטיים60 , כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs45. ניתן להשתמש בכל שלבי הציפוי והביו-פונקציונליזציה המוסברים בפרוטוקול זה עם כל ננו-חומר של תחמוצת ברזל/ברזל, באופן כללי. NW של תחמוצת ברזל / ברזל שימשו כאן כדוגמה. התוצאות מראות כי NWs פונקציונלי נוגדנים יש אנטיגניות גבוהה קולטנים פני התא ספציפיים, אשר יכול לשמש עבור יישומים שונים. דוגמאות כוללות הפרדת תאים, אספקת תרופות, טיפול ספציפי בתאים סרטניים באמצעות טיפולים פוטותרמיים ו / או מגנטו-מכניים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge)</td>
			<td>Eppendorf, Fisherscientific</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES)</td>
			<td>Thermscientific</td>
			<td>AC172590250</td>
			<td>Concentration 0.1 M and pH 4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PG82079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>919302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL glass tube</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>03-339-22C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate ( flat bottom)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550990</td>
			<td>Clone 515, concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td>Concentration 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Concentration 35%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability reagent</td>
			<td>AlamarBlue,Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colon cancer cells - HCT116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardwood Hammer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any hammer tool can be used, there is no specific brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ELAN 9000 ICP-MS</td>
			<td>The used software is &#34;Elan instrument control session&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Retort Stand with Clamp</td>
			<td>RVFM</td>
			<td>13-0140</td>
			<td>This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td>Microplate Manager 6 software (#168-9520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td>Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker (Microplate Genie)</td>
			<td>Scientific Industries (Genie)</td>
			<td>SI-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor blades</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>08410-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydrixide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Concentration 1 M, pH 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>106627-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Fisherscientific</td>
			<td>05-400-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath (2510)</td>
			<td>Branson</td>
			<td>2489502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biofunctionalization of magnetic nanomaterials

ננו-חומרים מגנטיים זכו לתשומת לב רבה ביישומים ביו-רפואיים שונים. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים אלה עם סוכני מיקוד ספציפיים היא היבט חיוני לשיפור יעילותם באבחון ובטיפולים תוך מזעור תופעות הלוואי. היתרון של ננו-חומרים מגנטיים בהשוואה לננו-חומרים שאינם מגנטיים הוא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים ללא מגע ולמרחקים גדולים. זה מאפשר להנחות או לצבור אותם, בעוד שהם יכולים גם להיות פיקוח. לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) עם תכונות ייחודיות פותחו עבור יישומים ביו-רפואיים. המומנט המגנטי הגדול של NW אלה מאפשר שליטה יעילה יותר מרחוק על תנועתם על ידי שדה מגנטי. זה נוצל בהצלחה רבה בטיפול בסרטן, אספקת תרופות, מעקב אחר תאים, התמיינות תאי גזע או הדמיית תהודה מגנטית. בנוסף, ייצור NW על ידי תצהיר אלקטרוכימי בסיוע תבנית מספק שיטה רב-תכליתית עם שליטה הדוקה על תכונות NW. במיוחד NW ברזל תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה) NW מתאימים ליישומים ביו-רפואיים, בשל המגנטיזציה הגבוהה שלהם רעילות נמוכה.
בעבודה זו, אנו מספקים שיטה לתפקוד ביולוגי של NW של תחמוצת ברזל/ברזל עם נוגדנים ספציפיים המכוונים כנגד סמן פני תא ספציפי המתבטא יתר על המידה במספר רב של תאים סרטניים. מכיוון שהשיטה מנצלת את התכונות של משטח תחמוצת הברזל, היא ישימה גם לננו-חלקיקי תחמוצת ברזל על-פאראמגנטיים. ה- NWs מצופים תחילה ב- 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) הפועל כמקשר, אליו הנוגדנים מחוברים באופן קוולנטי. ציפוי APTES והביו-פונקציונליזציה של הנוגדנים מוכחים על ידי ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) ומדידות פוטנציאליות zeta. בנוסף, האנטיגניות של הנוגדנים על NWs נבדקת באמצעות immunoprecipitation ו כתם מערבי. המיקוד הספציפי של NWs ביו-פונקציונליים והתאימות הביולוגית שלהם נחקרים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי ובדיקת כדאיות התא.

חשוב לחתוך את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) כדי שיתאימו לצינור שבו משתמשים. לאחר הוספת 1 M NaOH לחתיכות אל, תגובה צריכה להתחיל מיד, אשר נצפתה על ידי יצירת בועות. אם לא מתרחשת תגובה תוך דקה אחת או אם התגובה מהירה מאוד והתמיסה הופכת עכורה לחלוטין עם ענן לבן, הסר מיד את תמיסת NaOH הישנה והחלף אותה בתמיסה חדשה. בדוק את ערך ה- pH של תמיסת NaOH. זה צריך להיות pH>12. כאשר ה-NWs משתחררים מחתיכות ה-Al ב-30 הדקות הראשונות עם NaOH, ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) יצופו בתוך תמיסת NaOH. בשלב האחרון של שחרור NWs, הפתרון צריך להיות הומוגני. שום אשכול של NWs לא צריך להיות שם (איור 3B). אם NW נאספו עם מגנט במשך 3 דקות, התמיסה צריכה להיות ברורה, וגלולת NW צריכה להיות שחורה (איור 3C). אם הגלולה הייתה אפורה, השליכו את הצינורית והתחילו שוב עם דגימת Al חדשה.
במהלך תהליך השחרור, NWs מקבלים שכבת תחמוצת ברזל טבעית עם עובי סביב 5 ננומטר, אשר דומה לדיווחים קודמים11,16,20. לשכבת תחמוצת זו תרומה חשובה לתאימות ביולוגית 16, פונקציונליות16,18 ותכונות מגנטיות20 של NWs. עם זאת, שמירה על NWs בתבנית שלהם (כלומר, לא לשחרר אותם) עד הצורך תמנע מהם השפעות סביבתיות עליהם. הקוטר והאורך הממוצעים של ה-NW לאחר תהליך השחרור היו 2.5 מיקרומטר ו-41.5 ננומטר, בהתאמה. ניתן לחשב את המסה של NW יחיד כפי שמוסבר בטבלה 1 והיא אושרה על ידי ספקטרוסקופיית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). כאן, כל דיסק אלומינה הכיל סביב 0.3 מ"ג ברזל.
כדי להפחית את הצבירה של NWs לאחר שחרורם ולאפשר פונקציונליות נוספת, NWs צופו ב-APTES. ציפוי זה מספק קבוצות אמין חופשיות ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים39,45, מה שהופך אותו מתאים לציפוי NW רב מקטעים כגון NW ברזל / זהב. במהלך ציפוי ננו-חוטים, חשוב להתמקד בשני דברים. ראשית, חשב את הנפח הדרוש ממולקולות APTES62 בהתבסס על שטח הפנים והמסה של NWs. חישובים אלה הוצגו בלוח 2. שנית, שמור על ננו-חוטים בתנועה רציפה כדי למנוע הצטברות שלהם וחסימה של חלקים מסוימים של משטחי NW מציפוי APTES. לדוגמה, בפרוטוקול זה, הננו-חוטים הודגרו תחת האמבטיה העל-קולית והמסובב במהלך ציפוי APTES ותפקוד הנוגדנים, בהתאמה. כל מולקולת APTES מכילה אטום סיליקון וקבוצת אמין פונקציונלית טרמינלית21. לכן, ניתן להשתמש במפות ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) כדי לאשר את נוכחותו של ציפוי APTES על-ידי הצגת אטומי סיליקון (צבע ורוד) על פני השטח של NW (איור 4A). לעומת זאת, אטומי NW שאינם מצופים מראים אטומי ברזל בכחול קליפה (איור 4B) ואטומי תערובת ברזל/חמצן בכחול בהיר (איור 4B). מיפוי EELS המתאים של NW לא מצופה (איור 4C,4D) מראה עוצמה גבוהה יותר של ברזל לעומת חמצן במרכז (איור 4C) מאשר על פני השטח (איור 4D), מה שמצביע על מבנה תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה). מיפוי EELS (איור 4 C,4D) זוהה כי שכבת תחמוצת הברזל על NWs היא Fe 3 O4 יותר מאשר Fe2O3, בדומה לפרסום קודם20.
ניתן לאשר את האנטיגניות של הנוגדנים המצורפים באמצעות מבחני IP ו-WB, שבהם ניתן לצפות בפס על הדגימה החיובית אך לא על קבוצת הבקרה השלילית (איור 5). שימו לב שכדי לשמור על פס ברור, אין להשתמש בפחות מ-0.1 מ"ג NWs/10 x 106 תאים. בדיקת BCA (טבלה של חומרים) בשילוב עם כמה חישובים המוצגים בטבלה 3 שימשה לכימות מספר הנוגדנים על NW.
יתר על כן, מדידת פוטנציאל הזטה שימשה להבהרת פונקציונליות פני השטח. קבוצת האמינים הסופיים ב-APTES הפחיתה את המטען השלילי של NW ללא ציפוי, כפי שניתן לראות באיור 6. NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים גם שינו את המטען בהשוואה ל-NW מצופה APTES (איור 6). כל מדידות פוטנציאל הזטה נעשו ב-pH 7.
ניתן לאשר את מיקוד התאים הספציפיים של NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 7). יש לבדוק את התאימות הביולוגית של כל ננו-חומר חדש לפני תחילת כל יישום. לכן, נעשה שימוש בבדיקת כדאיות התא, והיא אישרה שה-NW הלא-מצופה, המצופה APTES והנוגדנים היו תואמים ביולוגית אפילו עם ריכוז גבוה (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg"> איור 1: סכמטי מייצג את שיטת הציפוי והביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים. (A) ציפוי ברזל NW עם APTES. (B) הפעלת הנוגדנים באמצעות EDC + Sulfo-NHS, כדי שיהיה בסוף (C) ננו-חוט פונקציונלי של נוגדן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg"> איור 2: דיסק אלומיניום שהושקע בברזל. (א) דיסק האלומיניום לפני החיתוך. (B) הקווים האדומים הראו היכן לחתוך את הדיסק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg"> איור 3: שלבי שחרור ננו-חוטים. (A) אשכולות של ננו-חוטים צפים בתמיסת NaOH. התמונה צולמה 10 דקות לאחר הוספת NaOH ולאחר הסרת קרום Al . (B) ננו-חוטים המרחפים באתנול. התמונה צולמה בשלב השחרור האחרון, מיד לאחר שלב הסוניקציה. (C) גלולת ננו-חוט שחורה שנאספה על ידי מגנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg"> איור 4: מפת ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה של אלקטרונים (EELS). (A) ננו-חוט מצופה APTES (APTES-NW). הצבעים הכחול והוורוד מייצגים אטומי ברזל וסיליקון, בהתאמה. (B) ננו-חוט לא מצופה (NW). צבעי הכחול והתכלת מייצגים את מיפוי תערובת הברזל והברזל/חמצן, בהתאמה. מיפוי EELS המתאים של (C) הליבה ו-(D) המעטפת של NW שאינם מצופים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg"> איור 5: אישור תפקוד ופעילות של ננו-חוטים מצומדים של נוגדנים. האנטיגניות של CD44-NWs אושרה באמצעות משקעים חיסוניים (IP) וכתם מערבי (WB). +Ve: מייצג את הבקרה החיובית (ליזט תא מלא). -Ve: מייצג את הבקרה השלילית (רק NW לא מצופה). - תאי CD44: מייצג תאים שאינם מבטאים אנטיגן CD44; + תאי CD44: מייצג תאי סרטן המעי הגס המבטאים אנטיגן CD44. זהו כתם מייצג של n = 3 ניסויים עצמאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg"> איור 6: ערכים פוטנציאליים של Zeta עבור NWs, APTES-NW ונוגדנים. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg"> איור 7: תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מראות את המיקוד הספציפי. CD44-NWs מוצגים מתחברים (A ו- C), בעוד שה- Isotype-NWs (בקרה שלילית) לא התחברו (B ו - D). הצבעים אדום, כחול וירוק מייצגים את קרום התא, הגרעין וצביר CD44-NWs, בהתאמה. A ו- B הן תמונות השדה הבהירות של C ו- D, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg"> איור 8: מחקר כדאיות התא של תאי סרטן המעי הגס (HCT116) מודגרים עם פורמולציות שונות של ננו-חוטים. התאים טופלו ב-NWs לאחר 24 שעות של דגירה ולאחר מכן הודגרו במשך 24 שעות עם NWs. כל הניסויים בוצעו בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>ערך</td>
			<td>יחידה</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr><tr><td>אורך Fe NW (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>רדיוס (קוטר/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>צפיפות Fe (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>גר'/ס"מ3</td>
		</tr><tr><td>1 נפח Fe NW (V) = π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>ס"מ 3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe NW מסה = V x D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>1 שטח פנים Fe NW = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>מיקרומטר2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: חישוב מסת הברזל NW.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>ערך</td>
			<td>יחידה</td>
		</tr><tr><td>צפיפות APTES/100 μL*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr><tr><td>מולקולר ווייט (MW) של APTES</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>גר'/מול</td>
		</tr><tr><td>מספר שומה APTES = מסה / MW</td>
			<td>4.29ה-03</td>
			<td>מול</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES/100 μL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>מולקולות</td>
		</tr><tr><td>גודל APTES ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>ננומטר</td>
		</tr><tr><td>שטח הפנים של APTES</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr><tr><td>שטח פנים NW ****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr><tr><td>מספר NWs ב 0.3mg של NW ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>NWs</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES הדרושות ליצירת שכבה אחת סביב NW</td>
			<td>1.38E+06</td>
			<td>מולקולת APTES</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES הדרושות עבור 0.3 מ"ג של NWs</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>מולקולת APTES</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*שבירה מספר 61</td>
		</tr><tr><td colspan="3">** מספר מולקולות = מספר מול*אבוגדרו (6E+23)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">שבירה מספר 62</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מטבלה 1</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: חישוב מספר מולקולות APTES הדרושות לציפוי NWs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> </td>
			<td>נוגדן IgG בצורת Y</td>
			<td>NW</td>
		</tr><tr><td>מסה לנוגדן אחד</td>
			<td>2.3E-13 מיקרוגרם</td>
			<td>1.8E-08 מיקרוגרם*</td>
		</tr><tr><td>שטח פנים לנוגדן אחד</td>
			<td>23 נאנומטר2</td>
			<td>2.6E+05 נאנומטר2</td>
		</tr><tr><td>מבוסס על בדיקת BCA</td>
			<td colspan="2">0.3 מ"ג ל-1 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולת הנוגדן ו- NW ב- 0.3 מ"ג נוגדנים למ"ג NW</td>
			<td colspan="2">~1E + 15 נוגדנים ** לכל ~ 5.6E + 10 NW</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולת נוגדנים לכל NW</td>
			<td colspan="2">~2E+04 נוגדנים לכל 1 NW***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*מחושב מטבלה 1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">**מספר הנוגדנים ב-0.3 מ"ג חושב על ידי חלוקת מספר הנוגדנים שקיבלנו מבדיקת BSA (0.3 מ"ג) במשקל המולקולרי הממוצע של נוגדני IgG בצורת Y (180 kDa = 3E-16 מ"ג).</td>
		</tr><tr><td colspan="3">בהתבסס על שטח הפנים של מולקולה אחת של נוגדני IgG בצורת Y (~23 nm2) ושטח הפנים של NW אחד (~2.6E+05 nm2), סביב 1E+04 נוגדנים יספיקו כדי ליצור שכבה אחת על NW. במקרה שלנו, צפיפות הנוגדנים הייתה גבוהה פי שניים מהכמות הצפויה. זה יכול להיות קשור לציפוי APTES המספק יותר זרועות המאפשר חיבור גבוה של הנוגדנים. מקרה זה מבטיח כי NW מכוסה במלואו עם נוגדנים ואת ההזדמנות עבור הנוגדן להיקשר אנטיגן פני התא, ללא קשר לכיוון של NWs יהיה גבוה. עם זאת, אם צפיפות הנוגדנים נמוכה מהמספר הצפוי (מולקולת נוגדנים 1E+04), סיכויי הקישור בין התא לבין NWs יהיו נמוכים יותר.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: חישוב מספר הנוגדנים על ננו-חוט.

Watch this Scientific Journal Video about Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials at JoVE.com

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול לתפקוד ביולוגי של ננו-חומרים מגנטיים עם נוגדנים עבור מיקוד תאים ספציפיים. כדוגמאות, אנו משתמשים בננו-חוטי ברזל כדי לתקוף תאים סרטניים.

ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.5K Views.  King Abdullah University of Science and Technology. בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול לתפקוד ביולוגי של ננו-חומרים מגנטיים עם נוגדנים עבור מיקוד תאים ספציפיים. כדוגמאות, אנו משתמשים בננו-חוטי ברזל כדי לתקוף תאים סרטניים.

Video: Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Bioimaging רשום של ננו לניטור האבחון והטיפול

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

הנקבובי הסיליקון microparticles למשלוח Therapeutics siRNA

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

תמיכה מטבולית של טוחנות, חי ברקמות המוח במהלך רכישת מיקרוסקופ תהודה מגנטית

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...