Bu yayında bildirilen araştırma, Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (KAUST) tarafından desteklenmiştir.

DİKKAT: Kullanmadan önce daima ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) bakın. Tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanı kullanın (koruyucu gözlükler, eldivenler, laboratuvar önlüğü, tam boy pantolonlar, burnu kapalı ayakkabılar). Tüm biyolojik reaksiyonları biyolojik çeker ocakta gerçekleştirin.
NOT: Bu protokolün, 3 x 104 antikor/KB yoğunluğa sahip anti-CD44 antikorları ile kaplanmış 0.36 mg demir/mL'ye eşdeğer 2 x 10 10 biyofonksiyonelleştirilmiş NW/mL üretmesi amaçlanmıştır. Demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) KB'leri 2.5 μm uzunluğunda ve 41.5 nm çapındadır.
1. Demir nanotellerin serbest bırakılması
NOT: Demir/demir oksit NW'lerin üretim süreci önceki bir yayında ayrıntılı olarak açıklanmıştır59.
<ol><li>Bir kesme matı üzerinde, alüminyum (Al) diskleri (Şekil 2A) tek kenarlı bir bıçak ve 2 mL'lik bir tüpe sığacak şekilde küçük bir çekiç kullanarak küçük parçalara (Şekil 2B) kesin. Küçük Al parçalarını tüpe aktarmak için cımbız kullanın.</li>
	<li>Küçük Al parçalarını içeren 2 mL'lik tüpü 1 mL 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile doldurun. Tüm Al parçalarının NaOH ile kaplandığından emin olun.</li>
	<li>Çözeltiyi kimyasal çeker ocak içinde oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.</li>
	<li>Cımbız kullanarak sadece Al parçalarını çıkarın ve serbest kalan NW'leri (siyah kümeler, Şekil 3A) 30 dakika daha NaOH solüsyonunda tutun. NaOH çözeltisini değiştirmeyin.</li>
	<li>2 mL'lik tüpü manyetik bir rafa yerleştirerek NW'leri toplayın ve eski 2 M NaOH çözeltisini çıkarmadan önce 1 dakika bekleyin. Taze NaOH çözeltisi ile değiştirin.</li>
	<li>NW'leri içeren 2 mL'lik tüpü 30 saniye boyunca sonikasyon yapın ve kimyasal bir davlumbaz içinde 1 saat bekletin.</li>
	<li>1.5-1.6 adımlarını en az dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>2 mL'lik tüpü manyetik rafa yerleştirerek NW'leri yıkayın ve 2 dakika bekleyin.</li>
	<li>NaOH çözeltisini atın ve 1 mL mutlak etanol ile değiştirin.</li>
	<li>Tüpü 30 saniye boyunca sonikleştirin.</li>
	<li>2 mL'lik tüpü manyetik rafa yerleştirin ve 2 dakika bekleyin.</li>
	<li>Eski mutlak etanol çözeltisini atın ve 1 mL taze mutlak etanol ile değiştirin ve 30 saniye boyunca sonikat yapın.</li>
	<li>Adım 1.11 ve 1.12'yi en az dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>NW'leri ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında 1 mL mutlak etanol içinde tutun.</li>
	<li>Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) kullanarak demir konsantrasyonunu ve dolayısıyla NW'leri ölçün. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ancak, uzun süreli depolama için, gerekli olana kadar NW'leri Al şablonundan serbest bırakmayın. Serbest bırakılan NW'lerin etanolde sık sonikasyon olmadan uzun süre çökeltilmesi, ayrılması için daha uzun sonikasyon sürelerine ihtiyaç duyacak kümelenmeler yaratacaktır.</li>
</ol>2. Nanotellerin APTES ile kaplanması
NOT: Bu protokolde, 100 μL APTES çözeltisi (yoğunluk 0.946 g/mL61), 1.6 x 107 m2/g NW'leri kaplamak için yeterlidir. Nanomalzemenin oranında veya kütlesinde bir değişiklik varsa, APTES hacmi buna göre ayarlanmalıdır.
<ol><li>NW'leri 1.14 mL'lik bir pipet kullanarak 5. adımdan 1 mL'lik bir cam tüpe aktarın.</li>
	<li>2 mL'lik tüpte kalan NW'leri toplamak için, boş 2 mL'lik tüpü 1 mL mutlak etanol ekleyerek iki kez yıkayın ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak 5 mL'lik cam tüpe aktarın.</li>
	<li>Pipeti kullanarak 100 μL APTES alın ve doğrudan KB çözeltisine ekleyin.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü cl üzerine ayarlayınamp bir laboratuvar imbik standının.</li>
	<li>5 mL cam tüpün yarısını ultrasonik banyo suyunun içine yerleştirin ve 1 saat boyunca sonikasyon yapın.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü ultrasonik banyodan çıkarın ve 400 μL deiyonize (DI) su ve ardından 20 μL 1 M NaOH (temel kataliz) ekleyin. DİKKAT: Önce DI suyunun eklenmesi önemlidir.</li>
	<li>2.5-2.6 adımlarında açıklandığı gibi 5 mL cam tüpü ayarlayın ve 1 saat daha sonikasyon yapın.</li>
	<li>5 mL'lik cam tüpü ultrasonik banyodan çıkarın.</li>
	<li>NW'leri toplamak için cam tüpün yanına 5 dakika boyunca bir mıknatıs yerleştirin.</li>
	<li>Süpernatanı 1 mL taze mutlak etanol ile değiştirin ve 10 saniye boyunca sonikat yapın.</li>
	<li>2.10-2.11 arasındaki adımları dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>Tüm NW'lerin süspansiyon etanolünü 1 mL'lik bir pipet kullanarak 5 mL'lik yeni bir cam tüpe aktarın. NOT: APTES kaplı NW'ler, ihtiyaç duyulana kadar etanol içeren bir cam tüp içinde saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>3. Nanotellerin biyofonksiyonelleştirilmesi
<ol><li>Antikorların aktive edilmesi NOT: Yaklaşık 3 x 104 kısım antikor/KB elde etmek için, 0.1 mg demir başına 30 μL antikor (1 mg/mL) kullanın.<ol><li>2 mL'lik bir tüpte, 0.4 mg 3-3-dimetil-aminopropil karbodiimid (EDC) ve 1.1 mg sülfo-N-hidroksisülfosüksinimid (Sulfo-NHS) 1 mL 2-N-morfolino etansülfonik asit hidrat (MES) (pH 4.7). NOT: EDC/sülfo-NHS karışımı kullanılmadan önce taze ve hazırlanmış olmalıdır.</li>
		<li>Yeni bir 2 mL'lik tüpte, sırasıyla 30 μL anti-CD44 antikoru (1 mg / mL), 960 μL 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7) ve 10 μL EDC / sülfo-NHS karışımı (adım 3.1.1'de hazırlanır) ekleyin.</li>
		<li>2 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10 x g'lık bir tüp çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>APTES kaplı nanotellerin hazırlanması<ol><li>Adım 3.1.3'teki 15 dakikalık inkübasyon sırasında, NW'leri toplamak için APTES kaplı NW tüpünün (adım 2.13'ten itibaren) yanına bir mıknatıs yerleştirerek NW'leri 2 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Etanolü atın ve 1 mL 0.1 M PBS (pH 7) ile değiştirin ve ardından 10 saniye boyunca sonikasyon yapın.</li>
		<li>3.2.1-3.2.2 adımlarını dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Adım 3.2.1'de açıklandığı gibi NW'leri toplayın ve 0.1 M PBS'yi atın. NW'leri herhangi bir çözelti olmadan tüpte tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikorların bağlanması<ol><li>Tüm aktive edilmiş antikor çözeltisini (adım 3.1.3'te hazırlanan) NWS tüpüne (3.2.4'te hazırlanan) aktarın ve 10 saniye boyunca sonikat yapın.</li>
		<li>Cam tüpü gece boyunca 4 °C'de döndürücüye yerleştirin.</li>
		<li>Adım 3.2.1'deki gibi bir mıknatıs kullanarak NW'leri toplayın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Reaksiyonu bloke etmek için 4 ° C'de 1 saat boyunca 1 mL% 2 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi eklenmesi.</li>
		<li>Antikor ile işlevselleştirilmiş NW'lerin antijenisitesini kontrol edin, örneğin, immünopresipitasyon (IP) ve western blot (WB) tahlilleri kullanarak. NOT: Daha iyi sonuçlar için, engelleme adımından hemen sonra IP, WB veya biyouyumluluk tahlilinde biyoişlevselleştirilmiş NW'leri kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Biyouyumluluk testi
NOT: NW'lerin biyouyumluluğunu incelemek için çeşitli hücre canlılığı deneyleri ve farklı hücre hatları kullanılabilir. Burada kullanılan NW'lerin konsantrasyonu önceki bir yayınadayanmaktadır 16. Hücre tohumlaması, KB biyofonksiyonelizasyonundan bir gün önce yapılmalıdır.
DİKKAT: Aşağıdaki adımların tümü biyogüvenlik kabini altında yapılmalıdır.
<ol><li>96 oyuklu bir plakada, McCoy'un hücre kültürü ortamında (100 μL/oyuk) süspanse edilmiş 4 x 104 kolon kanseri hücresi (HCT116 hücre hattı) ile dokuz kuyucuğu tohumlayın ve gece boyunca 37 °C ve %5 karbondioksitte (CO2) inkübatörün içine yerleştirin.</li>
	<li>NW'leri (adım 3.3.4'ten itibaren) adım 3.2.1'de olduğu gibi bir mıknatıs kullanarak toplayarak PBS ile yıkayın ve eski çözeltiyi 1 mL 0.01 M PBS (pH 7) ile değiştirin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>NW'leri (adım 4.2'den itibaren) adım 3.2.1'deki gibi bir mıknatıs kullanarak toplayarak ısıtılmış McCoy's ortamıyla yıkayın ve eski PBS'yi 1 mL ısıtılmış McCoy's ortamıyla değiştirin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Adım 3.2.1'deki gibi bir mıknatıs kullanarak NW'leri (adım 4.3'ten itibaren) toplama ve 1 mL ısıtılmış McCoy's ortamını 900 μL ısıtılmış McCoy's ortamıyla değiştirin. NW konsantrasyonu mL başına 0.02 mg NW olmalıdır.</li>
	<li>96 oyuklu plakayı (adım 4.1'den itibaren) inkübatörden biyogüvenlik kabinine alın.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabininin altında, eski ortamı hücrelerden atın ve 100 μL asılı NW'lerle değiştirin (adım 4.4'te hazırlanmıştır).</li>
	<li>Plakayı (adım 4.6'da hazırlanan) elle çalkalayın ve ardından inkübatörün içinde 37 °C ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, inkübatörden 96 oyuklu plakayı (adım 4.7'de hazırlanan) çıkarın. Biyogüvenlik kabininin altına, çok duvarlı pipeti kullanarak her bir oyuğa 11 μL hücre canlılığı reaktifi (Malzeme Tablosu) ekleyin.</li>
	<li>Plakayı plaka çalkalayıcı ile 10 s boyunca 10 x g hızında sallayın.</li>
	<li>Plakayı inkübatörde 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>96 oyuklu plakayı (adım 4.10'da hazırlanan) inkübatörden çıkarın. Hücre canlılığı reaktifinin (uyarma 540 nm, emisyon 590 nm) absorbansını ölçerek mikroplaka okuyucudaki (Malzeme Tablosu) plakayı okuyun.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Herhangi bir nanomalzeme imalat ve kaplama yönteminde olduğu gibi, kullanılan çözeltilerin yüksek kalitede olması gerekir. Serbest bırakma (1 M NaOH) ve işlevselleştirme (MES) çözeltileri birkaç kez yeniden kullanılabilir. Bununla birlikte, yeni bir işleme başlamadan önce pH değerlerini kontrol etmek çok önemlidir. Serbest bırakma adımında, NW'lerin NaOH ile yıkanması en az dört kez yapılmalıdır. Yıkama ne kadar iyi olursa, NW'lerin stabilitesi o kadar iyi olur ve o kadar az agrega olurlar. Oksit tabakası, etanol veya suya daldırıldığında NW'lerin stabilitesini arttırır63.
NW'lerin çapı ve uzunluğu, APTES ve antikorlarla kaplandıktan sonra etkilendi. Burada, çap 41.5 nm'den 70 nm'ye yükseldi ve NW'leri kıran sonikasyon adımları nedeniyle uzunluk 2.5 μm'den 1.6 μm'ye düştü. Bu nedenle, biyoişlevselleştirme adımından sonra KB'lerin morfolojisini karakterize etmek esastır.
Antikorların NW'lere bağlanması, amin grubu (APTES üzerinde) ve karboksil grubu (antikor üzerinde) arasındaki kovalent etkileşime dayanır. Bu nedenle, APTES kaplamasının varlığını doğrulamak, EELS haritalamasını kullandığımız önemli bir adımdır. Kaplama yöntemi güvenli ve basittir. Yüksek sıcaklıklara veya uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç duymaz. Ayrıca APTES kaplama, bir karboksil grubuna sahip diğer antikorların veya proteinlerin kovalent bağlanmasını sağlamak için bir bağlayıcı görevi görür.
NW'lerin bir antikorla biyofonksiyonelleştirilmesi durumunda, biyofonksiyonelleştirme işleminden sonra antikorların bağlanma bölgelerinin antijenikliği etkilenebilir. Bu sorunu araştırmak için IP ve WB yöntemi kullanılabilir. Bu protokolde bahsedilen biyofonksiyonelleştirme yönteminin kullanılması, antikorların belirli bir hücre reseptörüne yüksek antijeniteye sahip NW'lere bağlanmasına izin verecektir. Ayrıca, NW'lerin antikorlarla biyofonksiyonelleştirilmesi, burada ilgilenilen reseptör olan CD44 ile hücreleri hedefleme yeteneğini ekledi. Bu konfokal mikroskopi ile doğrulandı. Kaplamasız NW'lerin biyouyumluluğu yüksek olmasına rağmen (%>95), NW'lere APTES kaplama veya antikorların eklenmesi biyouyumluluklarını %100 artırmıştır.
Ayrıca, kaplama ve biyofonksiyonelleştirme protokolü verimli, ekonomik ve tekrarlanabilirdir. Diğer herhangi bir demir-demir oksit nanomalzemesine uygulanabilir olmalıdır, bu sayede hem kaplamanın hem de bağlı antikorların konsantrasyonu, nanomalzemenin yüzey alanına ve kütlesine göre optimize edilmelidir. Bu protokol genel laboratuvarda ortam koşullarında güvenle yapılabilir. Biyoişlevselleştirme, nanomalzemenin biyouyumluluğunu ve hedefleme yeteneklerini önemli ölçüde artırmıştır. Genel olarak, NW'ler nanomedikal uygulamalar için son derece umut verici malzemelerdir (çok modlu veya kombinatoryal tedaviler, hücre tespiti veya rehberliği ve biyolojik algılama dahil). Burada açıklandığı gibi biyoişlevselleştirme ile birlikte, daha fazla hassasiyet ve etkinlik için spesifik hücre hedeflemesi elde edilebilir.

Manyetik nanomalzemelerin benzersiz bir özelliği, manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ile de izlenebildikleri gibi, onları birçok yönden harekete geçirmek için faydalı bir şekilde kullanılabilen manyetik alanlara1 yanıt verme yetenekleridir. Yüksek frekansta alternatif bir manyetik alan uygularken, hipertermiye neden olabilecek ısı üretebilirler ve terapötik bir seçenek1 sağlarlar. Diğer bir yaklaşım, yakın kızılötesi (NIR) lazer 2,3 ile gerçekleştirilebilen fototermal tedavidir.
Çok sayıda manyetik nanomalzeme arasında demir oksit, manyetik ayırma, hipertermi 2,4, hücre rehberliği5, ilaç dağıtımı 6,7,8 ve MRG 9,10'da kontrast madde olarak biyolojik uygulamalarda en büyük ilgiyi görmüştür. Bunun nedeni, yüksek biyouyumlulukları 11,12, büyük manyetizasyon 11,12, kaplanabilme 9,13,14,15, ilaç taşıma yetenekleri 2,16, ilaçlarla işlevselleştirilebilmeyetenekleri 2,16 ve/veya hedefleme ajanları 12,13,17,18 ve optik enerjiyi ısıya dönüştürme yeteneği2. Son zamanlarda, MagForce, hipertermi tedavisi için demir oksit nanopartikülleri kullanan kanser hastaları üzerinde klinik deneylere başladı19.
Son zamanlarda, manyetik nanoteller (NW'ler) biyomedikal uygulamalar için giderek daha fazla kullanılmaktadır 3,11,16,20,21,22. Manyetik nanoboncuklarla benzer özelliklere sahiptirler, ancak anizotropik bir şekil ve çok büyük bir manyetik moment sunarlar, bu da manyeto-mekanik etkileri indüklemek için düşük frekanslı çalıştırma da dahil olmak üzere bir manyetik alan23,24 tarafından çok verimli bir uzaktan kumanda sağlar 25,26,27,28,29 . Sonuç olarak, NW'ler eksozom izolasyonu 30 hücre takibi 21, kanser tedavisi 3,11,16, ilaç dağıtımı 16,31,32 ve MRI kontrast maddesi 33 gibi farklı biyolojik uygulamalar için uygulanmıştır.
Spesifik hücre hedefleme yeteneğine sahip biyofonksiyonelleştirilmiş manyetik nanomalzemeler, biyomedikal uygulamalar ve hassas tıpta büyük potansiyele sahiptir34,35. Bu hedefleme ajanlarını eklemek için, nanomalzemeler üzerinde bir yüzey modifikasyonu gereklidir. Tipik olarak, tedavi edici ajanların bağlanmasını kolaylaştıran fonksiyonel bir grup sağlayan bir kaplamaya ihtiyaç duyarlar. Literatürde, manyetik nanomalzemeler için çok sayıda organik ve inorganik kaplama vardır. Nanomalzemeye immobilize edilebilen fonksiyonel gruba bağlı olarak, bu kaplamalar dört ana grupta kategorize edilebilir: karboksilik asit gruplarına dayalı moleküller, polimerler, histidin ve silan gruplarına dayalı moleküller.
Karboksilik asit gruplarına dayalı moleküller, yüzey modifikasyon yöntemlerinden biridir. Yüksek afiniteyi kullanır kaplama üzerindeki negatif karboksilik asit grubu ile manyetik nanomalzemeler üzerindeki pozitif yükarasında 36,37,38. Bir karboksilik asidin metal bir yüzeye bağlanma işlemi, metal-karboksilat tuzlarının oluşumunu veya karboksil grubunun metale yapışmasını içerebilir. Bununla birlikte, biyo-uygulamalar için üstün özelliklere sahip demir/altın veya nikel/altın KB'ler gibi çok segmentli KB'ler için39,40, bu tür kaplamalar kolayca uygulanamaz. Aynı anda iki farklı kaplama gerektirir: altın segmentlerini değiştirmek için tiyol grupları ve manyetik segmentler (demir veya nikel) için karboksil grupları38. Karboksil gruplarına dayalı bazı molekül örnekleri hematoporfirin, pimelik asit, palmitik asit ve 3-[(2-aminoetil) ditio] propiyonik asittir (AEDP)38. Polimerler kullanılarak manyetik nanomalzemelerin yüzey modifikasyonları bazı belirgin avantajlar sunar. Polimerlerin büyük moleküler ağırlığı nedeniyle, bir çözelti38 içindeki manyetik nanomalzemenin stabilitesini arttırır. Bununla birlikte, nanomalzemenin boyutunu önemli ölçüde artıracaktır38. Polivinilpirolidon (PVP), polietilenimin (PEI), arginin-glisin-D aspartik asit (RGD) ve polietilen glikol (PEG), yüzey modifikasyonları için en yaygın kullanılan polimerlerin bazı örnekleridir. Her birinin kendine has özellikleri vardır ve38 kullanır. Üçüncü yüzey modifikasyon yöntemi, bir histidin kaplama kullanmaktır. Histidin, nikel38 gibi sınırlı sayıda manyetik nanomalzemeye yüksek afiniteye sahip histidin amino asit yan zincirine sahip bir proteindir. Protein saflaştırma işlemleri için kullanılabilir 38,41,42. Nikel/altın NW'ler38 gibi çok segmentli NW'lere bir histidin kaplama da uygulanabilir. Bir nanomalzeme yüzeyinin silanizasyonu köklü bir süreçtir 38,43,44. Herhangi bir metal oksit yüzeyine üç tekli bağ yoluyla bağlanan bir silikon atomuna dayanır ve aynı zamanda bu silikon atomu, bir alkil zinciri38,43,44 aracılığıyla sonunda fonksiyonel gruba bağlanır. Bu kaplamanın avantajı serbest amin grupları sağlamasıdır ve sırasıyla nikel ve altın gibi hem manyetik hem de manyetik olmayan malzemeleri38,45 kaplama kabiliyetine sahiptir. Bu nedenle, salin grubuna dayalı moleküllerin kullanılması, çok segmentli NW'leri biyoişlevselleştirmek için pratik bir yoldur. Silan gruplarına dayalı bazı molekül örnekleri (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) ve (3-aminopropil) trimetoksisilan (APTMS)38,45'tir.
Kaplamaya bir hedefleme maddesinin eklenmesi, hastalıklı hücrelerin hem tanı hem de tedavisinde önemli bir rol oynayabilir ve aynı zamanda sağlıklı dokular üzerindeki yan etkileri en aza indirebilir46,47. Nanomalzemelerin yüzeyine bir hedefleme maddesinin eklenmesi, endositoz reseptörleri7 yoluyla hem hücresel seçici bağlanmayı hem de içselleştirmeyi arttırır. Bu hedefleme ligandları olmadan, nanomalzemeler, ligandlarla nanomalzemelere kıyasla daha düşük bir oranda bağlanan hücre zarları ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girer48. Kanser dokularını hedeflemenin zorluklarından biri, sağlıklı dokulara karakteristik benzerlikleridir. Bu nedenle, hedeflemenin başarısı esas olarak biyolojik hedef olarak kullanılacak uygun ligandın belirlenmesine bağlıdır49,50. Nanomalzemeleri kanser hücrelerine yönlendirmek için çeşitli hedefleme ajanları kullanılmıştır48,51 (örneğin, CD44, sağlıklı hücrelere kıyasla kanser hücrelerinde yüksek ekspresyonunedeniyle 52,53,54,55).
Hedefleme ajanları, yapıldıkları bileşenlere ve karmaşıklıklarına göre üç ana gruba ayrılabilir: aptamer tabanlı hedefleme, ligand tabanlı hedefleme ve antikor tabanlı hedefleme. Aptamerler, iki ve üç boyutlu yapılara katlanan ve onları belirli bir antijeni, çoğunlukla proteinleri hedefleyebilmelerini sağlayan, kimyasal olarak sentezlenmiş kısa DNA veya RNA-oligonükleotid zincirleridir56. Ligand bazlı hedefleme, peptitleri ve kısa amino asit zincirlerini içerir57. Antikor tabanlı hedefleme, tek zincirli değişken fragmanlar veya antijen bağlayıcı fragmanlar gibi tüm antikorun veya antikor fragmanlarının kullanılmasını içerir51. Bu yöntemin kullanılması, spesifik hedef antijenine yüksek bağlanma afinitesine sahip iki bağlanma bölgesine sahip olma avantajına sahiptir, bu da ona son derece yüksek bir seçicilik verir58. Bağlanma bölgeleri bir kilide ve antijen bir anahtarabenzer 58.
Bu çalışmada, kullanılan NW'ler, önceki bir yayında ayrıntılı olarak açıklanan bir yöntem olan alüminyum oksit membranlar üzerine elektrodepozisyon yoluyla üretilmiştir59. Buradaki odak noktası, bu demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) NW'leri membranlardan salmak ve bir hedefleme yeteneği sağlamak için bunları spesifik antikorlarla biyofonksiyonelleştirmektir. Antikorlar doğrudan demir-demir oksit NW'lere bağlanamaz ve bir bağlayıcı gerektirir. NW'lerin APTES ile kaplanması, antikorlar üzerindeki karboksil grubu aracılığıyla kovalent bağlanmayı sağlayan serbest amin grupları sağlar (Şekil 1). APTES kaplamanın avantajı, demir/altın veya nikel/altın NW'ler45 gibi hem manyetik21 hem de manyetik olmayan60 malzemeler için çalışabilmesidir. Bu protokolde açıklanan tüm kaplama ve biyofonksiyonelleştirme adımları, genel olarak herhangi bir demir / demir oksit nanomalzemesi ile kullanılabilir. Burada örnek olarak demir/demir oksit KB'ler kullanılmıştır. Sonuçlar, antikorla işlevselleştirilmiş NW'lerin, farklı uygulamalar için kullanılabilen spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine karşı yüksek bir antijeniteye sahip olduğunu göstermektedir. Örnekler arasında hücre ayrımı, ilaç dağıtımı, fototermal ve/veya manyeto-mekanik tedaviler kullanılarak spesifik kanser hücresi tedavisi yer alır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge)</td>
			<td>Eppendorf, Fisherscientific</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES)</td>
			<td>Thermscientific</td>
			<td>AC172590250</td>
			<td>Concentration 0.1 M and pH 4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PG82079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>919302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL glass tube</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>03-339-22C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate ( flat bottom)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550990</td>
			<td>Clone 515, concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td>Concentration 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Concentration 35%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability reagent</td>
			<td>AlamarBlue,Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colon cancer cells - HCT116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardwood Hammer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any hammer tool can be used, there is no specific brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ELAN 9000 ICP-MS</td>
			<td>The used software is &#34;Elan instrument control session&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Retort Stand with Clamp</td>
			<td>RVFM</td>
			<td>13-0140</td>
			<td>This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td>Microplate Manager 6 software (#168-9520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td>Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker (Microplate Genie)</td>
			<td>Scientific Industries (Genie)</td>
			<td>SI-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor blades</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>08410-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydrixide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>Concentration 1 M, pH 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>106627-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Fisherscientific</td>
			<td>05-400-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath (2510)</td>
			<td>Branson</td>
			<td>2489502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biofunctionalization of magnetic nanomaterials

Manyetik nanomalzemeler farklı biyomedikal uygulamalarda büyük ilgi görmüştür. Bu nanomalzemelerin spesifik hedefleme ajanları ile biyofonksiyonelleştirilmesi, yan etkileri en aza indirirken teşhis ve tedavilerdeki etkinliklerini artırmak için çok önemli bir husustur. Manyetik nanomalzemelerin manyetik olmayanlara kıyasla avantajı, manyetik alanlara temassız bir şekilde ve büyük mesafelerde yanıt verebilmeleridir. Bu, onları yönlendirmeye veya biriktirmeye izin verirken, aynı zamanda izlenebilirler. Son zamanlarda, biyomedikal uygulamalar için benzersiz özelliklere sahip manyetik nanoteller (NW'ler) geliştirilmiştir. Bu NW'lerin büyük manyetik momenti, hareketlerinin bir manyetik alan tarafından daha verimli bir şekilde uzaktan kontrol edilmesini sağlar. Bu, kanser tedavisinde, ilaç dağıtımında, hücre izlemede, kök hücre farklılaşmasında veya manyetik rezonans görüntülemede büyük başarı ile kullanılmıştır. Ek olarak, şablon destekli elektrokimyasal biriktirme yoluyla KB üretimi, KB özellikleri üzerinde sıkı kontrole sahip çok yönlü bir yöntem sağlar. Özellikle demir NW'ler ve demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) NW'ler, yüksek manyetizasyonları ve düşük toksisiteleri nedeniyle biyomedikal uygulamalar için uygundur.
Bu çalışmada, çok sayıda kanser hücresinde aşırı eksprese edilen belirli bir hücre yüzeyi belirtecine karşı yönlendirilmiş spesifik antikorlarla demir/demir oksit NW'leri biyoişlevselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Yöntem, demir oksit yüzeyinin özelliklerini kullandığından, süperparamanyetik demir oksit nanopartiküllerine de uygulanabilir. NW'ler ilk olarak, antikorların kovalent olarak bağlandığı bir bağlayıcı görevi gören 3-aminopropil-tri-etoksi-silan (APTES) ile kaplanır. APTES kaplaması ve antikor biyofonksiyonelleştirmesi, elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) ve zeta potansiyeli ölçümleri ile kanıtlanmıştır. Ek olarak, NW'ler üzerindeki antikorların antijenitesi, immünopresipitasyon ve western blot kullanılarak test edilir. Biyofonksiyonelleştirilmiş NW'lerin spesifik hedeflenmesi ve biyouyumlulukları, konfokal mikroskopi ve bir hücre canlılığı testi ile incelenmiştir.

Alüminyum (Al) disklerin (Şekil 2A) kullanılan tüpe sığması için küçük parçalara (Şekil 2B) kesilmesi önemlidir. Al parçalarına 1 M NaOH eklendikten sonra, kabarcıkların oluşturulmasıyla gözlemlenen bir reaksiyon hemen başlamalıdır. 1 dakika içinde herhangi bir reaksiyon meydana gelmezse veya reaksiyon çok hızlıysa ve çözelti beyaz bir bulutla tamamen bulanıklaşırsa, eski NaOH çözeltisini hemen çıkarın ve yeni bir çözelti ile değiştirin. NaOH çözeltisinin pH değerini kontrol edin. pH>12 olmalıdır. NW'ler NaOH ile ilk 30 dakika içinde Al parçalarından serbest bırakıldığında, NW'ler (siyah kümeler, Şekil 3A) NaOH çözeltisi içinde yüzüyor olacaktır. NW'lerin serbest bırakılmasının son adımında, çözelti homojen olmalıdır. Orada hiçbir KB kümesi olmamalıdır (Şekil 3B). NW'ler 3 dakika boyunca bir mıknatısla toplandıysa, çözelti berrak olmalı ve NW peleti siyah olmalıdır (Şekil 3C). Pelet griyse, tüpü atın ve yeni bir Al numunesi ile tekrar başlayın.
Serbest bırakma işlemi sırasında, NW'ler, önceki raporlara benzer şekilde, yaklaşık 5 nm kalınlığında doğal bir demir oksit tabakası eldeeder 11,16,20. Bu oksit tabakasının KB'lerin biyouyumluluğuna 16, fonksiyonelleşmesine 16,18 ve manyetik özelliklerine20 önemli katkısı vardır. Bununla birlikte, NW'leri ihtiyaç duyulana kadar şablonlarında tutmak (yani serbest bırakmamak), üzerlerinde herhangi bir çevresel etki olmasını önleyecektir. Serbest bırakma işleminden sonra KB'lerin ortalama çapı ve uzunluğu sırasıyla 2.5 μm ve 41.5 nm idi. Tek bir KB'nin kütlesi Tablo 1'de açıklandığı gibi hesaplanabilir ve endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) ile doğrulanır. Burada, her alümina disk yaklaşık 0.3 mg demir içeriyordu.
NW'lerin serbest bırakıldıktan sonra toplanmasını azaltmak ve daha fazla işlevselleştirmeyi sağlamak için NW'ler APTES ile kaplandı. Bu kaplama, serbest amin grupları sağlar ve hem manyetik hem de manyetik olmayan malzemeleri39,45 kaplama kabiliyetine sahiptir, bu da onu demir/altın NW'ler gibi çok segmentli NW'lerin kaplanması için uygun hale getirir. Nanoteller kaplama sırasında iki şeye odaklanmak önemlidir. İlk olarak, NW'lerin yüzey alanına ve kütlesine bağlı olarak APTES moleküllerinden62 gerekli hacmi hesaplayın. Bu hesaplamalar Tablo 2'de sunulmuştur. İkinci olarak, topaklanmalarını ve KB yüzeylerinin bazı kısımlarının APTES kaplamasından tıkanmasını önlemek için nanotelleri sürekli hareket halinde tutun. Örneğin, bu protokolde, nanoteller sırasıyla APTES kaplama ve antikor fonksiyonelizasyonu sırasında ultrasonik banyo ve döndürücü altında inkübe edildi. Her APTES molekülü, bir silikon atomu ve bir terminal fonksiyonel amin grubu21 içerir. Bu nedenle, elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) haritaları, KB yüzeyinde silikon atomlarını (pembe renk) göstererek APTES kaplamasının varlığını doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 4A). Buna karşılık, kaplanmamış NW'ler, demir atomlarını kabuk mavisi (Şekil 4B) ve demir/oksijen karışımı atomlarını açık mavi (Şekil 4B) olarak gösterir. Kaplanmamış NW'lerin karşılık gelen EELS haritalaması (Şekil 4C,4D), merkezde (Şekil 4C) yüzeydekinden (Şekil 4D) daha yüksek bir demir-oksijen yoğunluğunu gösterir ve bu da bir demir-demir oksit (çekirdek-kabuk) yapısını gösterir. EELS haritalaması (Şekil 4 C,4D), KB'ler üzerindeki demir oksit tabakasının Fe 3 O4 Fe2O3olduğundan daha fazla olduğu tespit edildi, bu da önceki bir yayın20'ye benzer.
Bağlı antikorların antijenisitesi, pozitif numune üzerinde bir bandın gözlenebildiği, ancak negatif kontrollerde gözlenemediği IP ve WB testleri kullanılarak doğrulanabilir (Şekil 5). Net bir bant gözlemlemek için 0.1 mg'dan az NW / 10 x 106 hücre kullanmayın. Tablo 3'te sunulan bazı hesaplamalarla birlikte BCA testi (Malzeme Tablosu), KB'deki antikor sayısını ölçmek için kullanıldı.
Ayrıca, yüzey fonksiyonelleşmesini aydınlatmak için zeta-potansiyel ölçümü kullanılmıştır. APTES üzerindeki terminal amin grubu, Şekil 6'da gösterildiği gibi, kaplanmamış NW'lerin negatif yükünü azaltmıştır. Antikorla işlevselleştirilmiş NW'ler, APTES kaplı NW'lere kıyasla yükü de değiştirdi (Şekil 6). Tüm zeta-potansiyel ölçümleri pH 7'de yapıldı.
Antikorla işlevselleştirilmiş NW'lerin spesifik hücre hedeflemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanabilir (Şekil 7). Herhangi bir yeni nanomalzemenin biyouyumluluğu, herhangi bir uygulamaya başlamadan önce test edilmelidir. Bu nedenle, hücre canlılığı testi kullanıldı ve kaplanmamış, APTES kaplı ve antikor kaplı NW'lerin yüksek konsantrasyonda bile biyouyumlu olduğunu doğruladı (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg"> Şekil 1: Şematik, nanotellerin kaplama ve biyofonksiyonelleştirme yöntemini temsil eder. (A) Demir NW'lerin APTES ile kaplanması. (B) Sonunda (C) antikor ile işlevselleştirilmiş bir nanotel elde etmek için EDC + Sulfo-NHS kullanarak antikorların aktive edilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg"> Şekil 2: Demir birikintili alüminyum disk. (A) Kesimden önceki alüminyum disk. (B) Kırmızı çizgiler diskin nerede kesileceğini gösteriyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg"> Şekil 3: Nanotel serbest bırakma adımları. (A) Nanotellerin kümeleri NaOH çözeltisi içinde yüzer. Görüntü, NaOH eklendikten 10 dakika sonra ve Al membranı çıkarıldıktan sonra çekildi. (B) Etanol içinde süspanse edilmiş nanoteller. Fotoğraf, sonikasyon adımından hemen sonra, son serbest bırakma adımında çekildi. (C) Bir mıknatıs tarafından toplanan siyah nanotel peleti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg"> Şekil 4: Elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) haritası. (A) APTES kaplı nanotel (APTES-NW). Mavi ve pembe renkler sırasıyla demir ve silikon atomlarını temsil eder. (B) Kaplanmamış nanotel (NW). Kabuk mavisi ve açık mavi renkleri, sırasıyla demir ve demir/oksijen karışımı haritalamasını temsil eder. Kaplanmamış KB'lerin çekirdeğinin ve (D) kabuğunun karşılık gelen EELS haritalaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg"> Şekil 5: Antikor konjuge nanotellerin işlevselleşmesinin ve aktivitesinin doğrulanması. CD44-NW'lerin antijenitesi immünopresipitasyon (IP) ve western blot (WB) kullanılarak doğrulandı. +Ve: pozitif kontrolü (tam hücre lizatı) temsil eder. -Ve: negatif kontrolü temsil eder (yalnızca kaplanmamış KB). – CD44 hücreleri: CD44 antijenini eksprese etmeyen hücreleri temsil eder; + CD44 hücreleri: CD44 antijenini eksprese eden kolon kanseri hücrelerini temsil eder. Bu, n = 3 bağımsız deneyin temsili bir lekesidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg"> Şekil 6: NW'ler, APTES-NW'ler ve antikor için zeta potansiyel değerleri. Çubuklar ortalama ± standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg"> Şekil 7: Konfokal mikroskobik görüntüler spesifik hedeflemeyi göstermektedir. CD44-NW'ler ekli (A ve C) gösterilirken, İzotip-NW'ler (negatif kontrol) bağlanmadı (B ve D). Kırmızı, mavi ve yeşil renkler sırasıyla hücre zarını, çekirdeği ve CD44-NW kümesini temsil eder. A ve B, sırasıyla C ve D'nin parlak alan görüntüleridir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg"> Şekil 8: Farklı nanotel formülasyonları ile inkübe edilmiş kolon kanseri hücrelerinin (HCT116) hücre canlılığı çalışması. Hücreler, 24 saatlik inkübasyondan sonra NW'lerle muamele edildi ve daha sonra NW'lerle 24 saat inkübe edildi. Tüm deneyler 37 °C'de bir inkübatör içinde gerçekleştirildi. Çubuklar ortalama ± standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametre</td>
			<td>Değer</td>
			<td>Birim</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr><tr><td>Fe KB uzunluğu (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>μm</td>
		</tr><tr><td>Yarıçap (çap/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>μm</td>
		</tr><tr><td>Fe yoğunluğu (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>g/cm3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe KB hacim (V)= π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>cm3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe KB kütle = V x D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>μg</td>
		</tr><tr><td>1 Fe KB yüzey alanı = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>μm2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>deniz mili2</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Demir KB kütlesinin hesaplanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametre</td>
			<td>Değer</td>
			<td>Birim</td>
		</tr><tr><td>APTES/100 μL'nin yoğunluğu*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr><tr><td>APTES'in molekül gücü (MW)</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>g/mol</td>
		</tr><tr><td>APTES mol sayısı = kütle/MW</td>
			<td>4.29E-03</td>
			<td>Mol</td>
		</tr><tr><td>APTES molekül sayısı/100 μL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>Molekül</td>
		</tr><tr><td>APTES boyutu ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>Nm</td>
		</tr><tr><td>APTES yüzey alanı</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>deniz mili2</td>
		</tr><tr><td>KB yüzey alanı****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>deniz mili2</td>
		</tr><tr><td>0.3 mg KB'deki NW sayısı ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>KB'ler</td>
		</tr><tr><td>KB çevresinde bir katman oluşturmak için gereken APTES moleküllerinin sayısı</td>
			<td>1,38E+06</td>
			<td>APTES molekülü</td>
		</tr><tr><td>0.3 mg NW için gereken APTES molekülü sayısı</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>APTES molekülü</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Referans numarası 61</td>
		</tr><tr><td colspan="3">** Molekül sayısı = Mol sayısı*avogadro sayısı (6E+23)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Referans numarası 62</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Tablo 1'den</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: NW kaplaması için gerekli APTES moleküllerinin sayısının hesaplanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> </td>
			<td>Y-şekilli IgG antikoru</td>
			<td>NW</td>
		</tr><tr><td>Bir antikor için kütle</td>
			<td>2.3E-13 μg</td>
			<td>1,8E-08 μg*</td>
		</tr><tr><td>Bir antikor için yüzey alanı</td>
			<td>23 deniz mili2</td>
			<td>2,6E+05 deniz mili2</td>
		</tr><tr><td>BCA testine göre</td>
			<td colspan="2">1 mg başına 0.3 mg</td>
		</tr><tr><td>Bir mg KB başına 0.3 mg antikordaki antikor molekülünün ve KB'nin sayısı</td>
			<td colspan="2">~5.6E+10 NW başına ~1E+15 antikor **</td>
		</tr><tr><td>KB başına antikor molekülü sayısı</td>
			<td colspan="2">1 KB başına ~2E+04 antikor***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Tablo 1'den hesaplanmıştır</td>
		</tr><tr><td colspan="3">**0.3 mg'daki antikor sayısı, BSA testinden aldığımız antikor sayısının (0.3 mg) Y-şekilli IgG antikorlarının ortalama moleküler ağırlığına (180 kDa = 3E-16 mg) bölünmesiyle hesaplandı.</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Y-şekilli IgG antikorlarının bir molekülünün (~23 nm2) yüzey alanına ve bir KB'nin (~2.6E+05 nm2) yüzey alanına bağlı olarak, KB üzerinde bir tek tabaka oluşturmak için yaklaşık 1E+04 antikoru yeterli olacaktır. Bizim olgumuzda antikor yoğunluğu beklenen miktardan iki kat daha fazlaydı. Bu, antikorların yüksek bağlanmasına izin veren daha fazla kol sağlayan APTES kaplaması ile ilgili olabilir. Bu durum, KB'nin antikorlarla tamamen kaplanmasını sağlar ve KB'lerin yöneliminden bağımsız olarak antikorun bir hücre yüzeyi antijenine bağlanma olasılığı yüksek olacaktır. Bununla birlikte, antikor yoğunluğu beklenen sayıdan (1E+04 antikor molekülü) düşükse, hücre ile NW'ler arasındaki bağlanma şansı daha düşük olacaktır.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Nanotel üzerindeki antikor sayısının hesaplanması.

Watch this Scientific Journal Video about Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials at JoVE.com

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Bu çalışmada, manyetik nanomalzemeleri spesifik hücre hedeflemesi için antikorlarla biyofonksiyonelleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Örnek olarak, kanser hücrelerini hedeflemek için demir nanoteller kullanıyoruz.

Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.5K Görüntüleme.  King Abdullah University of Science and Technology. Bu çalışmada, manyetik nanomalzemeleri spesifik hücre hedeflemesi için antikorlarla biyofonksiyonelleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Örnek olarak, kanser hücrelerini hedeflemek için demir nanoteller kullanıyoruz.

Video: Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Teşhis ve Tedavi İzleme Nanomalzemelerin Kayıtlı bio

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Biyomühendislik

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Demir Oksit Nanopartiküller ile Fonksiyonlu Manyetik Bakteriyel Nanocellulose Fabrikasyon

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Metabolik destek çıkardım, yaşam beyin dokuları manyetik rezonans mikroskobu Alım sırasında

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...