עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי R15 2 GM061539-02 (לBAS), 2 R15 NS40425-03 (לjel), MH 66,179 (לד&quot;ר גארי בנקר של אורגון לבריאות ומדע באוניברסיטה / OHSU), וP30 NS061800 (ד&quot;ר סו Aicher של OHSU). אנו מודים לברברה Smoody לתמיכה נרחבת בתרבות של תאי עצב בהיפוקמפוס, ובני זוג. בריאן ארוך וג&#39;יימס Abney לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA מקודד הכימרה photoconvertible או photoactivatable הממוקד לDCVs, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות. הערה: אפשרות אחת היא קידוד DNA plasminogen activator רקמות-Dendra2 הכימרה (tPA-Dendra2). Dendra2 הוא חלבון photoconvertible שעובר מירוק לפליטה אדומה בחשיפה ל12 אור אולטרה סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים בהיפוקמפוס תרבות ב# כיסוי 1.5 ביצועים גבוהים מחליק ל~ 5-10 ימים, בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect לפתח נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מגיב שומנים קטיוני. הערה: הזיהום בתיווך ויראלי הוא יעיל יותר לתאים בוגרים. גישה חלופית זו תוארה בפירוט במקומות אחרים 14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צינור 1.5 מיליליטר מכיל ~ 1 מיקרוגרם של ה-DNA ו250 μl של מדיום מינימאלי חיוני (MEM) וצינור 1.5 מיליליטר שני המכיל 4 μl של מגיב השומנים קטיוני ו250 μlשל ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפתרונות למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב בין שני פתרונות ודגירה את התערובת במשך 30 דקות נוספות וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין את מנה המכילה כמה מיליליטר של מדיום התרבות חיממה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את התלושים לכסות מכילים נוירונים לצלחת המכילה מדיום חם ומוסיף את תערובת transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את הצלחת בעדינות ולאחר מכן למקם אותו בחממה ב37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור לנוירונים &quot;הצלחת הביתה&quot; שלהם ולחכות ~ 12-18 שעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את תאי דקות 45 ב4% paraformaldehyde סוכרוז 4% / בופר פוספט (PBS, pH 7.4) חימם ל37 ° C. הערה: בניסויי PALM, חשוב להשיג שימור טוב של ultrastructure, ופרוטוקולי קיבעון פורמלדהיד סטנדרטיים המשמשים עבור מכתים immunofluorescence הם בדרך כלל לא מספיק 15. אחת סיבות חשובות לשימור מבני עניים היא f מספיקזמן ixation בגלל קיבעון פורמלדהיד כרוך היווצרות adduct וcrosslinking חלבון, והתהליך השני הוא איטי למדי 16. קיבעון דקות 45 מסייע להפחית את הבעיה הזו ללא הפסד הנגרם overfixation לגילוי של הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי לשטוף מחליק ~ 10x עם PBS המסונן. הערה: זו מפחיתה מזהמים ניאון. דגימות תמונה במהירות יחסית לאחר קיבוע. בתאי ביניים, לאחסן ב 4 ° C בPBS המסונן במכל אור חזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התלושים לכסות הר המכילים תאי עצב בתא ב-PBS המסונן. הערה: המדגם חייב להיות מותקן במדיום מימית, כמו PBS, עם מקדם שבירה נמוכה מזו של זכוכית, ליישם הקרינה כוללת פנימית השתקפות (TIRF) מבוססת תאורה. תאורה מבוססת TIRF היא מאוד שימושית כי fluorophores להחליק הפרוקסימלי כיסוי רק שמחים, ויש ירידה קשורה גדולה בקרינת רקע 17. </li></ol> 2. רכישת תמונה &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת ההדמיה ברזולוציה סופר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדלק את מנורת הקשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעיף את &quot;מערכת / המחשב&quot; ומתגים &quot;מרכיב&quot; (במתג מרחוק הכוח) ל&quot; על &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב (אחרי תחנת לוח / עגינה שליטת מיקרוסקופ מגיע על). הערה: תחנת העגינה יכולה לשמש כדי לשלוט ולפקח על תכונות רבות של אופטיקה ונתיב אור, בעיקר בחירה של מטרה ומיקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה ולבחור באפשרות &quot;מערכת ההפעלה&quot; בשיח הכניסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החזית ולוחות גישה עליונה על ארון בטיחות לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את זרוע האור המועברת לגשת לבמה ויעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שמן על הצמצם המספרי אלפא Plan-Apochromat 100X / NA = 1.46 אובייקטיבי (TIRF). הערה: מטרה גבוה NA 63X ניתן להשתמש בם במקום 100X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את המדגם על הבמה, ולהעלות את המטרת דואר למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטר את מיקום העדשה באמצעות פונקצית XYZ של תחנת העגינה. עצור כאשר העדשה היא באצטדיון של התמקדות (למשל, z ~ 2.50 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מלא לסגור את לוחות הגישה. הערה: כדי לעסוק בטיחות הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונן את הפוקוס באמצעות oculars ולחצנים בכרטיסיית אתר. הערה: כרטיסיית אתר מספקת גישה לכפתורים המייצרים תאורה מבוססת מנורת קשת ומאפשר תצפית ישירה של המדגם עם oculars. בדומה לכך, כרטיסיית הרכישה מספקת גישה לכלים המייצרים תאורה מבוססת לייזר ומאפשר ללכוד תמונה על ידי המצלמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסייה לאתר, לבחור &quot;טראנס על&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סמל ההרחבה העיני. שים לב: זה מעלה את סכמטי של נתיב האור. תכונות של נתיב האור ניתן לשנות על ידי לחיצה השמאלית סמלים מתאימים בסכמטית או על ידי שימוש במסך המגע בתחנת העגינה. לדוגמא, מסנןמתאים לצפייה פליטה מDendra2 ניתן לבחור באמצעות סמל אקדח רפלקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסתכל לתוך העיני, ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות תחנת העגינה כמדריך. הערה: המדגם יהיה מאוד מאוכלס בדלילות עם תאי ניאון כי נוירונים בהיפוקמפוס קשים transfect, ולכן יכולים להיות קצת מסובך להתמקד באמצעות התאורה באה לידי ביטוי. אם זה המקרה, השתמש בתאורה משודרת וקריאת z של תחנת העגינה כמדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתג את האור &quot;כבוי&quot; לאחר ההתמקדות. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את תא שהוא די בהיר, מציג הקרינה punctate, ויש לו מורפולוגיה קלאסית שמעידה על בריאות טובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אור מוחזר ומתאים מסנן לצפייה פליטה ירוקה מDendra2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את תלוש לכסות לתאים לבטא מפלצות Dendra2 באמצעות עירור בעצימות נמוך אור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לACQכרטיסיית uisition. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;מנהל הניסוי&quot; כדי לטעון את תצורת רכישת PALM אשר נועדה כראוי או בקלות שונה. הערה: אם אין ניסוי כזה קיים, לעצב תצורה ניסיונית החל שימוש בהגדרות הבאות כמדריך: מחווני כוח לייזר: 405 ננומטר (~ 0.01% לליזר mW 50); 488 ננומטר (~ 3% לליזר mW 100); 561 ננומטר (~ 40% לליזר mW 100); זמן חשיפה: ~ 50 אלפיות שניים; רווח מצלמה: ~ 200; רכישה רב ממדית: סדרת זמן (מחזורים = 30,000, מרווח = 0); שירים: ננומטר 488 עם עלית תאורה, וננומטר 561 עם תאורה מבוססת TIRF (ראה שלב 2.5.1); מטרה: 100X (NA = 1.46); מחוון זווית TIRF: שכיחות זווית ~ 67-72 °; גודל פיקסל: 100 ננומטר; שדה הראייה: TIRF (האפשרויות חלופיות להניב עוצמות לייזר גבוהות יותר ומשמשות לfluorophores שקשה יותר לאקונומיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;כן&quot; כאשר תפריט מוקפץ מופיע בשאילתא על מעבר בלייזרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את התמונהשל התא אל מוקד במטוס המצלמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מסלול לייזר עלית תאורת 488 ננומטר. שים לב: מסלולי תצורות קרן משמשות במהלך הדמיה. כאן, שמות רצועות נקבעות על ידי העירור באורך הגל שמייצר הפליטה כי הוא עבר למצלמה. לדוגמא, מסלול ננומטר 561 משתמש הן 405 ו561 קווי לייזר ננומטר, אבל קוביית הסינון עוברת רק פליטה מDendra2 photoconverted נרגשת על ידי 561 ננומטר אור למצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקד את התמונה של התא במצלמה באמצעות הכפתור &quot;הרציף&quot; הרכישה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף תמונת widefield קונבנציונלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלחצן &quot;הצמד&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונה על ידי לחיצה על התפריט &quot;הקובץ&quot; והבחירה באפשרות &quot;שמירה / שמירה בשם.&quot; </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התאורה מבוססת TIRF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסלול 488 ולעבור ל&quot; TIRF &quot;באמצעות הלחצן EPI / TIRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רכישה &quot;רציפה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם tמחוון תאורה הוא מבוסס TIRF. הערה: TIRF מושגת כאשר יש מחשיך פתאומי של רקע ויכול להיות ממוקד הדגימה באחת מטוס 18. אם התכונות חדשות לעין באמצעות התמקדות עד למדגם, זווית השכיחות נמוכה מדי, כי בTIRF יש רק אחד מטוס של מוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את זווית TIRF באמצעות המסלול 561 עם לייזר 405 ננומטר &quot;את&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את לייזר 405 ננומטר בחזרה &quot;על&quot; לפני ביצוע ניסוי PALM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים PALM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיט &quot;להתחיל את ניסוי.&quot; הערה: אם ירצה, לפתוח את לשונית &quot;אפשרויות עיבוד מקוונות&quot; וסמן את &quot;PALM המקוון עיבוד&quot; ו &quot;Fit Gauss2D&quot; (לפני תחילת הניסוי) כדי לפקח על תמונת PALM שוחזרה במהלך איסוף הנתונים גולמי. זה יקל על הערכה של איכות הנתונים ובכך כדאיויות המשך תהליך איסוף הנתונים יחסית זמן רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואליתלפקח photoconversion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את העצמה של לייזר 405 ננומטר (photoconverting) כאשר פוחת Dendra2 photoconversion (בדרך כלל לאחר רכישת ~ 10,000 תמונות גולמיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בניסוי אם עליות photoconversion. אחרת, לעצור את הניסוי (ללא אובדן נתונים) על ידי להכות את הכפתור &quot;עצור&quot; הצעד הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונות כאשר איסוף הנתונים הושלם (לאחר ~ 15 דקות). </li></ol></li></ol> 3. עיבוד תמונה, תצוגה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהעדר תמונות עיבוד, תהליך מקוון גלם שנשמרו בדיסק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית העיבוד, פתח את כרטיסיית השיטה, ובחר &quot;PALM&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;PALM&quot; שוב מארבעה suboptions. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכו לתפריט הקובץ, לפתוח ולראות את הקובץ של עניין, ופגע &quot;בחירה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hit &quot;חלים&quot;. הערה: פעולה זו תפעיל לוקליזציה שיא / ממצא fluorophore ושיא עם opti ברירת המחדלפיירפוקס. במידת צורך, פסגות גם יכולות להיות מקובצים באמצעות הכרטיסייה &quot;PAL-הקבוצה&quot;. קיבוץ מקצה פסגות המופיעות במספר פריימים ברציפות למולקולה בודדת אם קואורדינטות שיא הן דומות מספיק. בנוסף, ניתן לתקן את הנתונים לסחף מדגם באמצעות אפשרות היישור של התוכנה מבוססת מודל להיסחף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את הרכיבים בצורה גרועה מקומיים ונדגמו בצורה גרועה בנתונים מקומי השיא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל fluorophores בדיוק לוקליזציה, σ,&gt; 35 ננומטר שימוש באפשרות &quot;PAL-המסנן&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל fluorophores באזורים שבם ממוצע המרחק בין פסגות, ד, הוא גדול מדי כדי לפתור שלפוחית ​​של קוטר, ד &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את דיוק הלוקליזציה הממוצעת, σ, מהיסטוגרמה דיוק לוקליזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ערך מקסימאלי מקובל לד מבוסס על σ, וcriteron תנון-נייקוויסט 19, המגולמת ברזולוציה קירוב 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הסף באפשרות &quot;הסרה חריגים PALM&quot; למחוק פסגות מוקפות בפחות מ πD 2 / (4d 2) שכנים בתוך מעגל ברדיוס של ד / 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את נתוני PALM מעובדים לתמונת PALM שימוש באפשרות &quot;PAL-Rendering&quot;; ראה איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת גדלים והפרדות ידי בחירה בפונקציה &quot;הפרופיל&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הקו המשויך ואפשרויות שולחן, ולמתוח קו לאורך הכיוון הרצוי בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת קטרים ​​ידי קביעת רוחב מלא בעוצמה מקסימלי חצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת הפרדות על ידי קביעת מרווחים בין שיא לשיא של פרופילי עוצמה. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+a+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li><li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging.">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation.">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite.">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li><li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate.">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone:+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle.">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li><li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets.">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li><li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li><li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons.">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking.">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li><li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney:+A+kinetic+study+of+fixation.">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems.">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li><li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis.">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+localization+microscopy+(PALM):+an+optical+technique+for+achieving+~10-nm+resolution.">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity.">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li><li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes.">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

PALM ושיטות מיקרוסקופיה קשורות רזולוציה סופר הקרינה צמחו לאחרונה כהשלמה חשובה לצורות מבוססות יותר של מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופי אלקטרונים (EM) 22-24. תכונות חיוביות של PALM כוללות הכנת מדגם פשוט יחסית והפרעות מדגם מינימליות. באופן עקרוני, PALM גם יכול לשמש כדי לחקור תאי חיים. כנראה התכונה השלילית העיקרית של PALM היא רכישת נתונים זמן רב, אשר פוגעת באופן משמעותי את מחקרים של תהליכים דינמיים מהיר יותר בתאים חיים. בנוסף, PALM הוא חדש יחסית, ו, fluorophores חזק ובכך מתאים ופרוטוקולים להכנת מדגם ועבור רכישת נתונים וניתוח אינם מפותחים ו / או שתועדו באופן מלא 3. כאן יש לנו תיארתי פרוטוקול שמתאים ליחיד צבע מחקרים מבוסס PALM, של שלפוחית ​​בתאים קבועים, בתרבית. הפרוטוקול גם הוא נקודת התחלה טובה לפיתוח באופן דומהביימו, מחקרי PALM כפול צבע. היעילות של הפרוטוקול שלנו היא נתמכת על ידי שתי תכונות מפתח של נתונים PALM שלנו. ראשית, חלוקת puncta בכף שלנו שוחזרה, וwidefield המשלים, תמונות היא דומה מאוד. הבדל אחד המשמעותי בהפצה - הרזולוציה מזדמנת של puncta העקיפה המוגבל לpuncta מרובה על ידי PALM - משקף את הרזולוציה המשופרת במידה ניכרת של PALM ועוד מדגיש את היעילות של הטכניקה ושירות. שנית, תוצאות PALM שלנו הן בהסכם טוב, ו / או עולות בקנה אחד, עם תוצאות רלוונטיות אחרות. לדוגמא, תמונות של נוירונים בהיפוקמפוס שהושגו באמצעות EM מדי פעם לחשוף את הפרוסות דרך DCVs, וקוטר DCV להסיק מהפרוסות הוא ~ 70-100 ננומטר 11. ההסכם יוצא דופן בין נתוני PALM שלנו ואת נתוני EM מרגיע לשתי הגישות. PALM עדיין נבחנת, וEM בדרך כלל כפוף חששות לגבי הכנת המדגם הקשה הנדרשת ל. באופן דומה,סרטים מוגבלים דיפרקציה של חיים נוירונים בהיפוקמפוס coexpressing מפלצות ירוקות ואדום ממוקד לDCVs מראים כי puncta הירוק ואדום חופף לעבור comovement המתמשך 25. הפירוש הפשוט ביותר של תוצאה זו - האותות האדומים וירוקים להתעורר מאותו DCV - עולה בקנה אחד עם PALM, אשר מוכיח כי puncta העקיפה מוגבלת באופן גורף מייצג DCVs הבודד. פרשנות פחות פשוטה של ​​comovement - האותות האדומים וירוקים נובעים מDCVs אשכולות - הוא ייפסל במידה רבה על ידי פאלם. יש הפרוטוקול המתואר כאן תכונות חיוביות אחרות. בפרט, הכנת מדגם היא פשוטה יחסית ודי דומה לזה שמתאים למיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי, עם שני חריגים בולטים: (1) שלפוחית ​​חייבת להיות מסומנת עם fluorophores photoconvertible או photoactivatable, ו (2) תאים קבועים הם רכובים הטובים ביותר בתקשורת מימית. simplici יחסי זהty משקף את העובדה שהניסויים הם קצרים, ולכן דגימות לא צריכים להיות מתויגות עם חרוזים fiducial (כדי להקל על תיקון להיסחף), שיכול להיות מסובך 26. בנוסף, שלפוחית ​​בדרך כלל מתויגות עם fluorophores רבים; ובכך, השיג צפיפות תיוג fluorophore נאותה הוא פשוט. לעומת זאת, למבנים אחרים, זה יכול להיות קשה למדי 3. רכישת תמונה גם היא פשוטה יחסית. עם זאת, PALM דורש רכיבים אלקטרוניים ואופטיים שהם יקרים וחדשניים משום שאותות PALM הם מיסודם חלשים מאוד. כנראה ההיבטים המתוחכמים ביותר של מרכז PALM סביב העיבוד, ניתוח והתצוגה של תמונות PALM. כמודגש כאן, יישום היבטים של PALM אלה דורש הבנה של כמה נושאים עדינים, ובכלל זה את מערכת היחסים בין הדגימה ורזולוציה, ואת ההבחנה בין ברזולוציה ודיוק לוקליזציה. לכן, בסך הכל, PALM יםtudies תמיד הם די מורכב, אבל זה מאוזנת שיפור רזולוציה שעשויה להיות משמעותי.

מספר התהליכים התאיים תלוי בסחר בתיווך שלפוחית ​​מדויק ויעיל של ביומולקולות ליעדי subcellular ספציפיים. דוגמא בולטת אחת היא הרכבה הסינפטי, אשר קדמה משלוח נע ארוך, בתיווך שלפוחית ​​של מרכיבים הסינפטי מאתרים של קיום חיים בסומה העצבית לאתרים מראש וpostsynaptic פוטנציאל דיסטלי 1. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שיטה חזקה והפופולרית של לימוד סחר בשלפוחית. נקודות חוזק של הטכניקה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות 2. למרבה הצער, עד יחסית לאחרונה, הטכניקה סבלה מחולשה אחת גדולה, ברזולוציה מוגבלת דיפרקציה 2, דבר המקשה מחקרים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, ברזולוציה רוחב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלתה המחסום העקיפה עם ההקדמה של מיל הקרינה רזולוציה סופרטכניקות croscopy, כגון PALM 3. ברזולוציה הרוחב של PALM, עשרות ננומטרים, היא אידיאלית למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים שבדרך כלל נעים בין 50-250 ננומטר ~ 4. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של שלפוחית, כוללים כמה היבטים של הסחר שלהם לאתרי subcellular ספציפיים. PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאמים לסוג המערכת תחת מחקר. כאן אנו מתארים כיצד ליישם מחקרי PALM של מבני ועי, ואנחנו מדגימים את היעילות של הגישה שלנו למקרה של DCVs בנוירונים בהיפוקמפוס. בפרט, אנו משתמשים PALM להתייחס להשערה כי הסחר של DCVs לסינפסות בנוירונים בהיפוקמפוס מתווך על ידי אשכולות DCV 5-8. סחר בתיווך Cluster של שלפוחית ​​לסינפסות בפיתוח neurons היא אפשרות מעניינת, כי זה עשוי להקל על ייצוב הסינפטי מהיר והרכבה 9,10. חסידי סחר באשכולות של DCVs לצטט את הגודל נראים הגדול של puncta ניאון extrasynaptic מחסה מטען DCV אקסוגני כראיות התומכות באשכולות 6. עם זאת, puncta אלה מופיעים בתמונות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות עקיפה מוגבל הקרינה מיקרוסקופית, שאינם מתאימות לגודל אפקטים ייחודיים הנובעים מעקיפה מאלה הנובעים מאשכולות. כדי לפתור בעיה זו, אספנו הקרינה widefield קונבנציונלית ותמונות PALM של נוירונים בהיפוקמפוס להביע מפלצות ממוקדות לDCVs. ניתוח של התמונות הללו נחשף כי&gt; 92% מאשכולות DCV extrasynaptic המשוערת בתמונות קונבנציונליות נפתרים כ80 ננומטר puncta 11 (פרט DCV בגודל) בתמונות PALM. לפיכך, נתונים אלה במידה רבה לפסול את השערת האשכולות כפי שהוחל על DCVs בפיתוח hippocaנוירונים mpal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> זיהוי של הקרינה מספק את הבסיס לשיטות מיקרוסקופיה רבות מנוצלים באופן נרחב ומתקדמות במהירות המועסקות ביישומים ביולוגיים ורפואיים מודרניים. עוצמות של הקרינה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות. למרבה הצער, צורות מקובלות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סובלות מחולשה, ברזולוציה אחת גדולה עקיפה מוגבלת במטוס ההדמיה, אשר פוגעת לימודים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, מגבלה זו כבר להתגבר עם ההקדמה של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM). שלא כמו עמיתיהם קונבנציונליים שלה, PALM יכול להפיק תמונות ברזולוציה רוחב של עשרות ננומטרים. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של מבנה וארגון תאיים. _content &quot;&gt; לרוע המזל, PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאם לסוג המערכת תחת מחקר. במאמר זה, אנו מראים כיצד ליישם מחקרי PALM יחיד צבע של מבנים בועי בנוירונים קבועים, בתרבית. PALM הוא אידיאלי למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים, כי בדרך כלל נעים בין ~ 50-250 ננומטר. צעדי מפתח בגישה שלנו כוללים תיוג נוירונים עם photoconvertible (מירוק לאדום) מפלצות מטענים שלפוחית, איסוף תמונות גולמיות שנדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי להפיק תמונת PALM ברזולוציה גבוהה. אנחנו גם להדגים את היעילות של הגישה שלנו על ידי הצגת תמונות יוצאת דופן נפתרו היטב של שלפוחית ​​צפופות ליבות (DCVs) בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית, שלהפריך את ההשערה כי סחר extrasynaptic של DCVs מתווך בעיקר על ידי אשכולות DCV.

איור 1 מציג מוצר קצה אחד של הדמיה ועיבוד. בתמונת PALM זה, קואורדינטות רוחב של fluorophores מקומי מוצגות באמצעות מצב תצוגת centroid, והתמונה ברזולוציה העל של DCV הקשורים מוצגת באמצעות מצב תצוגת גאוס. איור 2 א מראה widefield מקביל ותמונות PALM של סומה ותהליכים הפרוקסימלי של שמונה ימים בתא העצב בהיפוקמפוס מבחנה להביע tPA-Dendra2. תכונות חשובות של התמונות כוללות (1) נרחבת, התאמה של אחד לאחד, וחפיפה, בין puncta בתמונות קונבנציונליות וPALM, (2) גודל קטן יותר באופן משמעותי של puncta PALM, ו (3) רזולוציה מזדמנת של &quot;פונקטום widefield בודד לתוך puncta PALM מרובה. איור 2 מראה תמונת כף DCVs לאורך חלק מתהליך של נוירון בהיפוקמפוס שני להביע tPA-Dendra2. חשובתכונות של תמונה זו כוללות (1) בקוטר קטן, ומראה הומוגני, של puncta, ו (2) תצפית נדירה של puncta / אשכולות DCV משוערים apposed מקרוב. איור 3 מתאר שיטה כמותית פשוטה של קביעה אם שתיים או יותר DCVs קרוב מספיק כדי מהווה אשכול; במערכות שבן אשכולות הוא שכיחים, בשיטות מתוחכמות יותר, המבוססות על פונקציות הפצה, יכולות לשמש לכימות 21. השיטה הפשוטה מבוססת על יצירת פרופילי קו של עוצמות puncta (מוצגות בגרפים), אשר יכול לשמש כדי לכמת הפרדת DCV ורוחב DCV. אם ההפרדה עולה על הרוחב באופן משמעותי (כפי שנדון במקרא), DCVs לא &quot;קשר&quot;, ואילו אם הפרדה היא בערך כמו רוחב, DCVs יכול ליצור קשר. בהתבסס על קריטריון זה, DCVs בפנל סווגו כ&quot; לא במגע &quot;, ואילו אלה שבלוח ב &#39;סווגו כבקון<html> טקט. שימוש בגישה זו, אנחנו שמים את הגבול עליון של ~ 8% באשכולות הקשורים קשר של DCVs extrasynaptic בפיתוח תאי עצב בהיפוקמפוס. גודל DCV שלנו ונתונים אשכול מסוכמים בטבלה 1. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig1.jpg" /> איור 1. כיסוי של תמונת PALM שניתנו גאוס של DCV (אדום) ותמונת PALM מצב centroid-צג המציגה את קואורדינטות של fluorophores הבודד photoconverted (נקודות לבנות) הנכלל בDCV. המצב לשעבר מציג fluorophores שניתנו לפונקציות גאוס עם רוחב נקבע על ידי בדיוק הלוקליזציה שלהם, ואחרון מציג fluorophores / פסגות כנקודות מקומיות בהם (x, y) קואורדינטות. בר = 0.1 מיקרומטר.t = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig2.jpg" /> איור 2. Overlay (א) לwidefield סיכם (ירוקה) וכף יד (אדום) תמונות של סומה ותהליכים הפרוקסימלי של נוירון בהיפוקמפוס פיתוח להביע tPA-Dendra2. אזורי חפיפה מופיעים צהובים / כתום. תמונת PALM (ב) לDCVs רירית subregion של תהליך של תא אחר להביע tPA-Dendra2. ברים = 5 ו 2 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51394/51394fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig3.jpg" /> איור 3. שכבות (<html> A ו-B) של widefield סיכם (ירוק) וכף יד (אדומה) תמונות של puncta בנוירון בהיפוקמפוס פיתוח להביע tPA-Dendra2. בשני הפנלים, תמונת widefield תערוכות &quot;פונקטום גדול אחד, ואילו תמונת PALM הקשורות פותרת &quot;פונקטום היחיד זה לשני puncta מצומצם הרבה יותר. הגרפים מראים פרופילי עוצמה באנלוגיה-מקודד לפי צבע המתקבלים עבור puncta בפנל (גרף משמאל) ובלוח ב &#39;(גרף מימין). הפרופילים הנגזרים מתמונת PALM בפנל תכנית שיש לי puncta רוחב מלא בעוצמה מקסימלי שמחצית היא ~ 40% מרווח השיא אל שיאם; וכך, שני puncta אלה הם לא במגע ולא סווג כמקבץ משוער. לעומת זאת, הפרופילים הנגזרים מתמונת PALM בB להראות פנל שיש לי puncta רוחב מלא בעוצמה מקסימלי חצי שהיא בעצם אותו הדבר כמו הריווח בין שיא לשיאם; וכך, אלה סווגו כמקבץ משוער. בר = 0.2 מיקרומטר./ &quot;= היעד&quot; _blank 51394fig3highres.jpg &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטר </td><td> תוצאה </td><td> מספר DCVs ניתח </td></tr><tr><td> העליון מחויב בDCVs התקבצו </td><td> 7.9 ± 5.9% </td><td> 618 </td></tr><tr><td> מתכוון בקוטר DCV </td><td> 77 ± 21 ננומטר </td><td> 60 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. גודל DCV וסיכום נתוני אשכול.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles at JoVE.com

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K Views.  Lewis & Clark College.  אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ב...

Video: Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית צפופות ליבות עצבית