פרוטוקול זה מאפשר לנו את היכולת לבודד לימפוציטים תאי T מחולים עם המחלה למחקרים, הפגם המולקולרי והפגם האימונולוגי. שיטה זו מאפשרת לנו לבודד תאים בני קיימא, תאים עם הפרעות מחלה לטיהור RNA, DNA וחלבון מחולים אלה ומאפשרת לנו לאפיין פגמים מולקולריים כדי להבין מסלולים חריגות החשובות בפתוגנזה. שיטה זו היא בעלת ערך לבידוד של דם היקפי שניתן לפצל עוד יותר כדי לחקור תאי דם במצבים נורמליים, כמו גם תאי דם ממחלות עם הפרעות חיסוניות.
מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אלנה, שהיא עמיתת מחקר סטודנטית לרפואה מהמעבדה שלי. לאחר קבלת דגימת דם היקפית בחמישה צינורות 10 מיליליטר המכילים נוגדי קרישה, מעבירים 10 עד 15 מיליליטר דם לתוך 50 צינורות הפרדת מיליליטר המסומנים במספר הנושא ומדללים את הדגימות לפחות פי שניים, אך ללא יותר מ -35 מיליליטר לכל צינור עם HBSS. בזהירות ובאיטיות מתחת לדם עם כ -13 מיליליטרים של צפיפות בינונית לכל צינור, לעצור את pipetting כאשר pipette הוא כמעט ריק כדי למנוע בועות.
הסר את הפיפטה באיטיות כדי למנוע ערבוב של שכבות דם וצפיפות בינוניות והעביר בזהירות את צינורות ההפרדה הממולאים לצנטריפוגה מבלי להפריע לשכבות. לאחר הפרדת התאים על ידי צנטריפוגה, הסר את כל 10 המיליליטרים האחרונים של הפלזמה המכילה את השכבה העליונה, לפני איסוף זהיר ואיטי של הפרווה הבאפית. אסוף את ציפוי הבאפי מבין שני צינורות הפרדה לצינור 50 מיליליטר סטרילי בעל תווית אחת ודילל את ה- PBMC לפחות פי שניים עם HBSS טרי לסך כולל של 50 מיליליטר לכל צינור.
לאחר שכל הפרווה הבאפית נאספה, סובבו את התאים על ידי צנטריפוגה והסירו כמה שיותר מהסופרנטנט מכל צינור. הקש על תחתית הצינור כדי לשחרר את הכדורית והחייא את הכדורים באחת עד שתי מיליליטרים של מאגר ACK lysis לכל נפח דגימת דם מקורי של 10 מיליליטר לכל צינור. לאחר חמש דקות בדיוק, עצרו את הליזה בכל צינור עם נפח שווה או גדול יותר של HBSS והתאימו כל נפח ל-50 מיליליטר.
לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט, אגדו את התאים מאותו תורם והביאו נפח של עד 50 מיליליטרים עם HBSS טרי לצנטריפוגה נוספת. לאחר מכן יש להחיות את התאים ב-10 מיליליטרים של 37 מעלות צלזיוס RP 10F בינוני לספירה. עבור טיהור תאי CD4+CD45RO+T, סובבו את התאים ודללו את ה-PBMC ל-PBMC ל-5 פעמים 10 עד לתאים השביעיים למיליליטר של ריכוז מאגר הברירה.
מעבירים את התאים לצינור פוליסטירן תחתון עגול של חמישה מיליליטר ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים לכל מיליליטר אחד של דגימה עם ערבוב עדין. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מערבולת חלקיקים מגנטיים במהירות גבוהה במשך 30 שניות לפני הוספת 50 מיקרוליטרים של חלקיקים מגנטיים לכל מיליליטר אחד של דגימה לצינור עם ערבוב עדין. הביאו את עוצמת הקול ל-2.5 מיליליטר עם מאגר בחירה רענן וערבוב עדין והניחו את הצינור על מגנט למשך 2.5 דקות.
בסוף הדגירה, הרימו את המגנט והפכו את הצינור בתנועה אחת רציפה כדי לנטרל את תרחיף התא המועשר לצינור סטרילי חדש. כדי להגביר את התאוששות התא, הוסיפו 2.5 מיליליטרים של מאגר סלקציה לצינור מבלי להפריע לחרוזים המשותקים במשך 2.5 דקות נוספות של דגירה על המגנט והוסיפו את הכביסה לצינור האיסוף, ואז ספרו את מספר התאים בני הקיימא באמצעות המוציטומטר ואישרו את טוהר התאים על ידי ציטומטריה של זרימה. כדי להפעיל את התאים, התאימו את תאי CD4+CD45RO+T ל-5 פעמים 10 לתאים השישיים למיליליטר בריכוז בינוני של 37 מעלות צלזיוס RP 10F וזרעו את התאים למנות תרבית בגודל מתאים.
תנוח את התאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני בן לילה. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים המנוחה על ידי צנטריפוגה ולהחזיר את הכדור ב 5 פעמים 10 עד התאים השישי לכל מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RP 10F ריכוז בינוני. פצל את ההשעיה ל-5 עד 10 פעמים 10 עד אליקוטים של התא השישי בכל אחד משלושת צינורות ההברגה הסטריליים ומעורר את התאים בצינור שני עם PMA וצינור שלוש עם A23187 וערבוב עדין.
הוסיפו נפח שווה של דימתיל סולפוקסיד לצינור הראשון שישמש כבקרת הרכב והניחו את הצינורות כאשר הצינורות השתחררו לתוך האינקובטור למשך תקופת ההפעלה המתאימה. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולהשליך כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. לאחר מכן שחררו את התאים לפי ההוראות של ערכת בידוד RNA הזמינה מסחרית ובודדו את הרנ"א בהתאם להוראת היצרן.
הכדאיות והטוהר של תאי CD4+CD45RO+T המתקבלים על ידי פרוטוקול בחירה שלילי זה גבוהים באופן עקבי. התשואה של תאי CD4+CD45RO+T המתקבלים מתאי מערכת לוקורדוקציה מ-SS PBMCs היא בדרך כלל כ-75% בהשוואה לכ-16% מ-PBMCs תורמים רגילים.
בנוסף, גנים רבים שאינם באים לידי ביטוי בדרך כלל בתאי T תורמים רגילים באים לידי ביטוי גבוה בתאי T של SS הן במנוחה והן בעקבות גירוי. טכניקה סטרילית טובה ושגרה עקבית חשובות מאוד להצלחת טכניקה זו. זה גם ממש חשוב בזמן שאתם מרכיבים את הפיקול שאתם משתמשים בפיפטה אוטומטית עם שליטה עדינה ואתם ממש שמים לב למהירות שאתם מניחים על הפיקול.
תאים שבודדו בשיטה זו יהיו בני קיימא ויוכלו לשמש למחקרי רעילות, מחקרים ביוכימיים מולקולריים לאפיון מסלולי התמרת אותות, ציטומטריה של זרימה ומחקרי ביטוי גנים. השיטה יכולה לשמש לבידוד תאים מחולים עם מחלות, למחלות דלקתיות, וגם למחלות אחרות כגון סרטן למחקרים ישירים. דוגמאות למחלות אלה כוללות פסוריאזיס ואטופיק דרמטיטיס.
