Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Lymphozyten-T-Zellen von Patienten mit der Krankheit für Studien, den molekularen Defekt und den immunologischen Defekt zu isolieren. Diese Methode ermöglicht es uns, lebensfähige Zellen, Zellen mit den Krankheitsanomalien für die Reinigung von RNA, DNA und Protein von diesen Patienten zu isolieren und molekulare Defekte zu charakterisieren, um Pathways-Anomalien zu verstehen, die in der Pathogenese wichtig sind. Diese Methode ist wertvoll für die Isolierung von peripherem Blut, das weiter fraktioniert werden kann, um Blutzellen in normalen Zuständen sowie Blutzellen von Krankheiten mit Immunanomalien zu untersuchen.
Alanna, eine medizinische studentische Forscherin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie eine periphere Blutprobe in fünf 10-Milliliter-Röhrchen erhalten haben, die Antikoagulans enthalten, geben Sie 10 bis 15 Milliliter Blut in 50-Milliliter-Trennröhrchen, die mit der Probandennummer gekennzeichnet sind, und verdünnen Sie die Proben mindestens zweifach, jedoch auf nicht mehr als 35 Milliliter pro Röhrchen mit HBSS. Unterlegen Sie das Blut vorsichtig und langsam mit etwa 13 Millilitern Dichtemedium pro Röhrchen und stoppen Sie das Pipettieren, wenn die Pipette fast leer ist, um Blasen zu vermeiden.
Entfernen Sie die Pipette langsam, um eine Vermischung der Blut- und Dichtemittelschichten zu vermeiden, und geben Sie die gefüllten Trennröhrchen vorsichtig in die Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören. Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation getrennt haben, entfernen Sie alle bis auf die letzten 10 Milliliter des Plasmas, das die obere Schicht enthält, bevor Sie vorsichtig und langsam das Buffy-Fell sammeln. Fassen Sie die Buffy-Schicht zwischen zwei Trennrohren zu einem einzigen sterilen 50-Milliliter-Röhrchen zusammen und verdünnen Sie das PBMC mindestens zweimal mit frischem HBSS auf insgesamt 50 Milliliter pro Röhrchen.
Wenn alle Buffycoats gesammelt wurden, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand aus jedem Röhrchen. Klopfen Sie auf den Röhrchenboden, um das Pellet zu lösen und die Pellets in ein bis zwei Milliliter ACK-Lysepuffer pro ursprünglichem 10-Milliliter-Blutprobenvolumen pro Röhrchen zu resuspendieren. Stoppen Sie nach genau fünf Minuten die Lyse in jeder Röhre mit einem gleichen oder einem größeren Volumen von HBSS und stellen Sie jedes Volumen auf 50 Milliliter ein.
Verwerfen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, sammeln Sie die Zellen desselben Spenders und bringen Sie das Volumen mit frischem HBSS für eine weitere Zentrifugation auf bis zu 50 Milliliter. Dann suspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern 37 Grad Celsius RP 10F Medium zum Zählen. Für die CD4 + CD45RO + T-Zellreinigung drehen Sie die Zellen herunter und verdünnen Sie die PBMC auf eine fünfmal 10 bis siebte Zelle pro Milliliter Selektionspufferkonzentration.
Übertragen Sie die Zellen in ein fünf Milliliter rundes Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden und fügen Sie 50 Mikroliter Antikörpercocktail pro Milliliter Probe mit sanftem Mischen hinzu. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wirbeln magnetische Partikel mit hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden auf, bevor 50 Mikroliter magnetische Partikel pro Milliliter Probe mit schonendem Mischen in das Rohr gegeben werden. Bringen Sie das Volumen mit frischem Auswahlpuffer und schonendem Mischen auf 2,5 Milliliter und legen Sie das Rohr für 2,5 Minuten auf einen Magneten.
Nehmen Sie am Ende der Inkubation den Magneten auf und drehen Sie das Rohr in einer kontinuierlichen Bewegung um, um die angereicherte Zellsuspension in ein neues steriles Rohr zu dekantieren. Um die Zellerholung zu erhöhen, fügen Sie 2,5 Milliliter Selektionspuffer in das Röhrchen hinzu, ohne die immobilisierten Perlen für eine weitere 2,5-minütige Inkubation auf dem Magneten zu stören, und fügen Sie die Wäsche dem Sammelrohr hinzu, dann zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und bestätigen Sie die Zellreinheit durch Durchflusszytometrie. Um die Zellen zu aktivieren, stellen Sie CD4+CD45RO+T-Zellen auf eine fünfmal 10 bis sechste Zelle pro Milliliter von 37 Grad Celsius RP 10F mittlerer Konzentration ein und säen Sie die Zellen auf entsprechend große Kulturschalen.
Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator ruhen. Am nächsten Morgen sammeln Sie die ausgeruhten Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet bei einer fünfmal 10 bis sechsten Zelle pro Milliliter von 37 Grad Celsius RP 10F mittlerer Konzentration. Teilen Sie die Suspension in fünf bis 10 mal 10 bis sechste Zellaliquoten in jeweils drei sterilen Schraubverschlussröhrchen auf und stimulieren Sie die Zellen in Röhrchen zwei mit PMA und Tube drei mit A23187 und schonendem Mischen.
Fügen Sie dem ersten Röhrchen, das als Fahrzeugsteuerung dient, ein gleiches Volumen Dimethylsulfoxid hinzu und platzieren Sie die Röhrchen mit den gelösten Kappen für die entsprechende Aktivierungsdauer in den Inkubator. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören. Dann lysieren Sie die Zellen nach Anweisung eines handelsüblichen RNA-Isolationskits und isolieren Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Die Lebensfähigkeit und Reinheit von CD4+CD45RO+T-Zellen, die durch dieses negative Selektionsprotokoll erhalten werden, ist konstant hoch. Die Ausbeute an CD4+CD45RO+T-Zellen, die aus Leukoreduktionssystemkammern von SS-PBMCs gewonnen werden, beträgt typischerweise etwa 75% im Vergleich zu etwa 16% von normalen Spender-PBMCs. SS-Speicher-T-Zellen und SS-PBMCs exprimierten Zytokin und andere Immunantwortgene im Vergleich zu Zellen aus normalen Spender-T-Zellen und PBMCs.
Darüber hinaus werden viele Gene, die normalerweise nicht in normalen Spender-T-Zellen exprimiert werden, in SS-T-Zellen sowohl in Ruhe als auch nach der Stimulation hoch exprimiert. Eine gute sterile Technik und eine konsequente Routine sind wirklich wichtig für den Erfolg dieser Technik. Es ist auch sehr wichtig, während Sie den Ficoll schichten, dass Sie eine automatische Pipette mit feiner Steuerung verwenden und Sie achten wirklich auf die Geschwindigkeit, mit der Sie den Ficoll ablegen.
Zellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, sind lebensfähig und können für Toxizitätsstudien, molekularbiochemische Studien zur Charakterisierung von Signaltransduktionswegen, Durchflusszytometrie und Genexpressionsstudien verwendet werden. Die Methode kann zur Isolierung von Zellen von Patienten mit Krankheit, für entzündliche Erkrankungen und auch für andere Krankheiten wie Krebs für direkte Studien verwendet werden. Beispiele für diese Krankheiten sind Psoriasis und atopische Dermatitis.
