Questo protocollo ci consente la possibilità di isolare le cellule T dei linfociti da pazienti con la malattia per studi, il difetto molecolare e il difetto immunologico. Questo metodo ci consente di isolare cellule vitali, cellule con anomalie della malattia per la purificazione di RNA, DNA e proteine da questi pazienti e che ci consente di caratterizzare i difetti molecolari per comprendere le anomalie dei percorsi che sono importanti nella patogenesi. Questo metodo è prezioso per l'isolamento del sangue periferico che può essere ulteriormente frazionato per studiare le cellule del sangue in stati normali, così come le cellule del sangue da malattie con anomalie immunitarie.
A dimostrare questa procedura sarà Alanna, che è una ricercatrice di studenti di medicina del mio laboratorio. Dopo aver ottenuto un campione di sangue periferico in cinque provette da 10 millilitri contenenti anticoagulante, trasferire da 10 a 15 millilitri di sangue in provette di separazione da 50 millilitri etichettate con il numero del soggetto e diluire i campioni almeno due volte, ma a non più di 35 millilitri per tubo con HBSS. Con attenzione e lentamente sottofondare il sangue con circa 13 millilitri di densità media per tubo, fermando il pipettaggio quando la pipetta è quasi vuota per evitare bolle.
Rimuovere lentamente la pipetta per evitare di mescolare gli strati medi di sangue e densità e trasferire con cura i tubi di separazione riempiti alla centrifuga senza disturbare gli strati. Dopo aver separato le cellule mediante centrifugazione, rimuovere tutti tranne gli ultimi 10 millilitri del plasma contenente lo strato superiore, prima di raccogliere con cura e lentamente il rivestimento buffy. Raggruppare il buffy coat tra due tubi di separazione in un singolo tubo sterile da 50 millilitri etichettato e diluire il PBMC almeno due volte con HBSS fresco per un totale di 50 millilitri per tubo.
Quando tutti i buffy coat sono stati raccolti, pellettare le cellule mediante centrifugazione e rimuovere il più possibile il surnatante da ciascun tubo. Toccare il fondo del tubo per allentare il pellet e risospese il pellet in uno o due millilitri di tampone di lisi ACK per volume di campione di sangue originale da 10 millilitri per tubo. Dopo esattamente cinque minuti, interrompere la lisi in ciascun tubo con un volume uguale o maggiore di HBSS e regolare ogni volume a 50 millilitri.
Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, raggruppare le cellule dello stesso donatore e portare volume fino a 50 millilitri con HBSS fresco per un'altra centrifugazione. Quindi risospese le celle in 10 millilitri di 37 gradi Celsius RP 10F mezzo per il conteggio. Per la purificazione delle cellule CD4 + CD45RO + T, ruotare le cellule e diluire il PBMC a cinque volte 10 alla settima cella per millilitro di concentrazione del tampone di selezione.
Trasferire le cellule in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri e aggiungere 50 microlitri di cocktail di anticorpi per un millilitro di campione con una miscelazione delicata. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, vorticiamo le particelle magnetiche ad alta velocità per 30 secondi prima di aggiungere 50 microlitri di particelle magnetiche per un millilitro di campione al tubo con una miscelazione delicata. Portare il volume a 2,5 millilitri con tampone di selezione fresco e miscelazione delicata e posizionare il tubo su un magnete per 2,5 minuti.
Alla fine dell'incubazione, raccogliere il magnete e invertire il tubo in un movimento continuo per decantare la sospensione cellulare arricchita in un nuovo tubo sterile. Per aumentare il recupero cellulare, aggiungere 2,5 millilitri di tampone di selezione al tubo senza disturbare le perle immobilizzate per un'altra incubazione di 2,5 minuti sul magnete e aggiungere il lavaggio al tubo di raccolta, quindi contare il numero di cellule vitali usando un emocitometro e confermare la purezza cellulare mediante citometria a flusso. Per attivare le cellule, regolare le cellule CD4 + CD45RO + T a cinque volte 10 alla sesta cella per millilitro di 37 gradi Celsius RP 10F media concentrazione e seminare le cellule su piatti di coltura di dimensioni adeguate.
Riposare le cellule in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius, 5% durante la notte. La mattina successiva, raccogliere le cellule riposate mediante centrifugazione e risospese il pellet a una concentrazione media di cinque volte 10 a sesta cella per millilitro di 37 gradi Celsius RP 10F. Dividere la sospensione in aliquote da cinque a 10 volte da 10 a sesta cella in ciascuno dei tre tubi sterili a vite e stimolare le celle nel tubo due con PMA e nel tubo tre con A23187 e miscelazione delicata.
Aggiungere un volume uguale di dimetilsolfossido al primo tubo per fungere da controllo del veicolo e posizionare i tubi con i tappi allentati nell'incubatore per il periodo di attivazione appropriato. Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e scartare il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi lisare le cellule come indicato da un kit di isolamento dell'RNA disponibile in commercio e isolare l'RNA secondo le istruzioni del produttore.
La vitalità e la purezza delle cellule CD4+CD45RO+T ottenute da questo protocollo di selezione negativa sono costantemente elevate. La resa delle cellule CD4+CD45RO+T ottenute dalle camere del sistema di leucoriduzione delle PBMC SS è in genere di circa il 75% rispetto a circa il 16% delle normali PBMC donatrici. Cellule T di memoria SS e PBMC SS scarsamente espresse citochine e altri geni di risposta immunitaria rispetto alle cellule di normali cellule T e PBMC donatrici.
Inoltre, molti geni non normalmente espressi nelle cellule T del donatore normale sono altamente espressi nelle cellule T SS sia a riposo che dopo la stimolazione. Una buona tecnica sterile e una routine costante sono davvero importanti per il successo di questa tecnica. È anche molto importante mentre stai stratificando il Ficoll che usi una pipetta automatica con un controllo fine e presti davvero attenzione alla velocità con cui stai posando il Ficoll.
Le cellule isolate con questo metodo saranno vitali e potranno essere utilizzate per studi di tossicità, studi biochimici molecolari per la caratterizzazione delle vie di trasduzione del segnale, citometria a flusso e studi di espressione genica. Il metodo può essere utilizzato per isolare le cellule da pazienti con malattia, per malattie infiammatorie e anche altre malattie come i tumori per studi diretti. Esempi di queste malattie includono la psoriasi e la dermatite atopica.
