Этот протокол позволяет выделить лимфоциты Т-клеток у пациентов с заболеванием для исследований молекулярного дефекта и иммунологического дефекта. Этот метод позволяет изолировать жизнеспособные клетки, клетки с аномалиями заболевания для очистки РНК, ДНК и белка от этих пациентов, и это позволяет нам охарактеризовать молекулярные дефекты, чтобы понять аномалии путей, которые важны в патогенезе. Этот метод ценен для выделения периферической крови, которая может быть дополнительно фракционирована для исследования клеток крови в нормальных состояниях, а также клеток крови от заболеваний с иммунными отклонениями.
Продемонстрировать эту процедуру будет Аланна, которая является научным сотрудником-медиком из моей лаборатории. После получения образца периферической крови в пяти 10-миллилитровых пробирках, содержащих антикоагулянт, переводят от 10 до 15 миллилитров крови в 50-миллилитровые разделительные пробирки, помеченные номером субъекта, и разбавляют образцы по меньшей мере в два раза, но не более чем до 35 миллилитров на трубку с HBSS. Осторожно и медленно подложите кровь примерно 13 миллилитрами плотности среды на трубку, останавливая пипетку, когда пипетка почти пуста, чтобы предотвратить пузырьки.
Медленно снимите пипетку, чтобы избежать смешивания слоев крови и плотности среды, и аккуратно перенесите заполненные разделительные трубки в центрифугу, не нарушая слои. После разделения клеток центрифугированием удалите все, кроме последних 10 миллилитров плазмы, содержащей верхний слой, прежде чем тщательно и медленно собрать пушистый слой. Сложите пушистый слой между двумя разделительными трубками в одну меченую стерильную 50-миллилитровую трубку и разбавьте PBMC по меньшей мере в два раза свежим HBSS до 50 миллилитров на трубку.
Когда все слои будут собраны, гранулируйте клетки центрифугированием и удалите как можно больше супернатанта из каждой трубки. Постучите по дну трубки, чтобы ослабить гранулу и повторно суспендировать гранулы в одном-двух миллилитрах буфера лизиса ACK на исходный объем образца крови 10 миллилитров на пробирку. Ровно через пять минут остановите лизис в каждой пробирке с равным или большим объемом HBSS и отрегулируйте каждый объем до 50 миллилитров.
После центрифугирования выбросьте супернатант, объедините клетки от того же донора и доведите объем до 50 миллилитров со свежим HBSS для другого центрифугирования. Затем повторно суспендируют клетки в 10 миллилитрах среды 37 градусов Цельсия RP 10F для подсчета. Для очистки CD4 + CD45RO + Т-клеток раскрутите клетки и разбавьте PBMC до пяти раз от 10 до седьмых клеток на миллилитр концентрации буфера отбора.
Переложите клетки в пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном и добавьте 50 микролитров коктейля антител на один миллилитр образца с мягким перемешиванием. Через пять минут при комнатной температуре вихрь магнитных частиц на высокой скорости в течение 30 секунд перед добавлением 50 микролитров магнитных частиц на один миллилитр образца в пробирку с мягким перемешиванием. Доведите объем до 2,5 миллилитров со свежим буфером отбора и мягким перемешиванием и поместите трубку на магнит на 2,5 минуты.
В конце инкубации возьмите магнит и переверните трубку одним непрерывным движением, чтобы декантировать обогащенную клеточную суспензию в новую стерильную трубку. Чтобы увеличить восстановление клеток, добавьте 2,5 миллилитра буфера отбора в трубку, не нарушая обездвиженных шариков, для еще одной 2,5-минутной инкубации на магните и добавьте промывку в сборную трубку, затем подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра и подтвердите чистоту клеток методом проточной цитометрии. Чтобы активировать клетки, отрегулируйте CD4 + CD45RO + Т-клетки до пяти раз 10 до шестой клетки на миллилитр средней концентрации 37 градусов Цельсия RP 10F и посейте клетки на чашки для культуры соответствующего размера.
Поместите клетки в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа на ночь. На следующее утро соберите отдохнувшие клетки путем центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в пять раз от 10 до шестой клетки на миллилитр средней концентрации 37 градусов Цельсия RP 10F. Разделите суспензию на пять-10 раз по 10-шестую ячейку аликвот в каждой из трех стерильных винтовых колпачковых трубок и стимулируйте клетки в трубке две с PMA и трубка три с A23187 и мягкое перемешивание.
Добавьте равный объем диметилсульфоксида в первую трубку, которая будет служить в качестве органа управления транспортным средством, и поместите трубки с ослабленными колпачками в инкубатор на соответствующий период активации. В конце инкубации соберите клетки путем центрифугирования и выбросьте как можно больше супернатанта, не нарушая клеточную гранулу. Затем лизируют клетки по указанию коммерчески доступного комплекта изоляции РНК и изолируют РНК в соответствии с инструкцией производителя.
Жизнеспособность и чистота CD4+CD45RO+T-клеток, полученных по этому протоколу отрицательного отбора, стабильно высока. Выход CD4+CD45RO+T-клеток, полученных из камер системы лейкоредукции из SS PBMCs, обычно составляет около 75% по сравнению с примерно 16% от нормальных донорских PBMCs. Т-клетки памяти SS и SS PBMCs плохо экспрессируют цитокин и другие гены иммунного ответа по сравнению с клетками из нормальных донорских Т-клеток и PBMCs.
Кроме того, многие гены, обычно не экспрессируемые в нормальных донорских Т-клетках, высоко экспрессируются в Т-клетках SS как в состоянии покоя, так и после стимуляции. Хорошая стерильная техника и последовательная рутина действительно важны для успеха этой техники. Также очень важно, когда вы наслаиваете Ficoll, что вы используете автоматическую пипетку с тонким управлением, и вы действительно обращаете внимание на скорость, с которой вы кладете Ficoll.
Клетки, выделенные с помощью этого метода, будут жизнеспособными и могут быть использованы для исследований токсичности, молекулярно-биохимических исследований для характеристики путей сигнальной трансдукции, проточной цитометрии и исследований экспрессии генов. Метод может быть использован для выделения клеток у пациентов с заболеваниями, при воспалительных заболеваниях, а также других заболеваниях, таких как рак, для прямых исследований. Примеры этих заболеваний включают псориаз и атопический дерматит.
