Este protocolo nos permite a capacidade de isolar linfócitos células T de pacientes com a doença para estudos, o defeito molecular e defeito imunológico. Este método nos permite isolar células viáveis, células com anormalidades da doença para purificação de RNA, DNA e proteína desses pacientes e que nos permite caracterizar defeitos moleculares para entender anormalidades de caminhos que são importantes na patogênese. Este método é valioso para o isolamento do sangue periférico que pode ser ainda mais fracionado para estudar células sanguíneas em estados normais, bem como células sanguíneas de doenças com anormalidades imunológicas.
Demonstrando este procedimento estará Alanna, que é pesquisadora de medicina do meu laboratório. Após obter uma amostra de sangue periférica em cinco tubos de 10 mililitros contendo anticoagulant, transfira de 10 a 15 mililitros de sangue em tubos de separação de 50 mililitros rotulados com o número do sujeito e diluir as amostras pelo menos duas vezes, mas para não mais do que 35 mililitros por tubo com HBSS. Cuidadosamente e lentamente suba o sangue com aproximadamente 13 mililitros de densidade média por tubo, parando a pipetação quando a pipeta está quase vazia para evitar bolhas.
Remova a pipeta lentamente para evitar misturar as camadas médias de sangue e densidade e transfira cuidadosamente os tubos de separação preenchidos para a centrífuga sem perturbar as camadas. Depois de separar as células por centrifugação, remova todos, exceto os últimos 10 mililitros do plasma contendo camada superior, antes de coletar cuidadosamente e lentamente a camada buffy. Acumule a camada buffy entre dois tubos de separação em um único tubo de 50 mililitros e diluir o PBMC pelo menos duas vezes com HBSS fresco para um total de 50 mililitros por tubo.
Quando todas as camadas de buffy tiverem sido coletadas, pelota as células por centrifugação e remova o máximo possível do supernatante de cada tubo. Bata no fundo do tubo para soltar a pelota e resuspenque as pelotas em um a dois mililitros de tampão de lise ACK por volume original de amostra de sangue de 10 mililitros por tubo. Após exatamente cinco minutos, pare a lise em cada tubo com um volume igual ou maior de HBSS e ajuste cada volume para 50 mililitros.
Após a centrifugação, descarte o supernadante, acumule as células do mesmo doador e traga volume de até 50 mililitros com HBSS fresco para outra centrifugação. Em seguida, resuspende as células em 10 mililitros de 37 graus Celsius RP 10F médio para contagem. Para purificação de células CD4+CD45RO+T, gire as células e dilua o PBMC para cinco vezes 10 para a sétima célula por mililitro de concentração de buffer de seleção.
Transfira as células para um tubo de poliestireno fundo redondo de cinco mililitros e adicione 50 microliters de coquetel de anticorpos por um mililitro de amostra com mistura suave. Após cinco minutos à temperatura ambiente, partículas magnéticas de vórtice em alta velocidade por 30 segundos antes de adicionar 50 microliters de partículas magnéticas por um mililitro de amostra ao tubo com mistura suave. Leve o volume para 2,5 mililitros com tampão de seleção fresco e mistura suave e coloque o tubo em um ímã por 2,5 minutos.
No final da incubação, pegue o ímã e inverta o tubo em um movimento contínuo para decantar a suspensão celular enriquecida em um novo tubo estéril. Para aumentar a recuperação celular, adicione 2,5 mililitros de tampão de seleção ao tubo sem perturbar as contas imobilizadas para outra incubação de 2,5 minutos no ímã e adicione a lavagem ao tubo de coleta, em seguida, conte o número de células viáveis usando um hemócito e confirme a pureza celular por citometria de fluxo. Para ativar as células, ajuste as células CD4+CD45RO+T para cinco vezes 10 a sexta células por mililitro de 37 graus Celsius RP 10F de média concentração e semee as células em pratos de cultura de tamanho adequado.
Coloque as células em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, colete as células descansadas por centrifugação e resuspense a pelota em cinco vezes 10 a sexta células por mililitro de 37 graus Celsius RP 10F de concentração média. Divida a suspensão em cinco a dez vezes 10 para a sexta célula aliquots em cada um dos três tubos de tampa de parafuso estéril e estimule as células no tubo dois com PMA e tubo três com A23187 e mistura suave.
Adicione um volume igual de sulfóxido de dimetil ao primeiro tubo para servir como controle do veículo e coloque os tubos com as tampas soltas na incubadora para o período de ativação adequado. No final da incubação, colete as células por centrifugação e descarte o máximo possível do supernatante sem perturbar a pelota celular. Em seguida, lise as células como orientado por um kit de isolamento RNA comercialmente disponível e isole o RNA de acordo com as instruções do fabricante.
A viabilidade e pureza das células CD4+CD45RO+T obtidas por este protocolo de seleção negativa é consistentemente alta. O rendimento de células CD4+CD45RO+T obtidas a partir de câmaras do sistema de leucoreduction de SS PBMCs é tipicamente de cerca de 75% em comparação com cerca de 16% de PBMCs de doadores normais. Células T de memória SS e SS PBMCs mal expressas citocinas e outros genes de resposta imune em comparação com células de células T e PBMCs doadores normais.
Além disso, muitos genes normalmente não expressos em células T doadoras normais são altamente expressos em células T SS tanto em repouso quanto seguindo a estimulação. Uma boa técnica estéril e uma rotina consistente são realmente importantes para o sucesso desta técnica. Também é muito importante enquanto você está colocando o Ficoll que você usa uma pipeta automática com controle fino e você realmente presta atenção na velocidade que você está estabelecendo o Ficoll.
As células isoladas usando este método serão viáveis e podem ser utilizadas para estudos de toxicidade, estudos bioquímicos moleculares para caracterização de vias de transdução de sinal, citometria de fluxo e estudos de expressão genética. O método pode ser utilizado para isolar células de pacientes com doença, para doenças inflamatórias, e também outras doenças, como cânceres para estudos diretos. Exemplos dessas doenças incluem psoríase e dermatite atópica.
