גישה לציטוטוקסיות ולתגובת התא לביו-חומרים

Summary

מתודולוגיה זו שואפת להעריך ציטוטוקסיות של חומרים ביולוגיים באמצעות הכנת תמציות מסיסות, תוך שימוש במבחני כדאיות וניתוח פנוטיפי, כולל ציטומטריית זרימה, RT-PCR, אימונוציטוכימיה וטכניקות ביולוגיה תאית ומולקולרית אחרות.

Abstract

ביו-חומרים באים במגע ישיר או עקיף עם רקמות האדם, ולכן חשוב להעריך את ציטוטוקסיותו. הערכה זו יכולה להתבצע במספר שיטות, אך קיים פער גבוה בין הגישות בהן נעשה שימוש, מה שפוגע ביכולת השחזור וההשוואה בין התוצאות המתקבלות. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול להערכת ציטוטוקסיות של ביו-חומרים באמצעות תמציות מסיסות, שבהן אנו משתמשים עבור ביו-חומרים דנטליים. הכנת התמציות מפורטת, החל מייצור הכדוריות ועד מיצוין במדיום תרבית. הערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרים מבוססת על פעילות מטבולית באמצעות בדיקת MTT, כדאיות התא באמצעות בדיקת Sulphorhodamine B (SBR), פרופיל מוות תאי באמצעות ציטומטריית זרימה, ומורפולוגיה של התא באמצעות May-Grünwald Giemsa. בנוסף להערכת ציטוטוקסיות, פרוטוקול להערכת תפקוד התא מתואר בהתבסס על ביטוי של סמנים ספציפיים המוערכים על ידי אימונוציטוכימיה ו- PCR. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לציטוטוקסיות של ביו-חומרים ולהערכת השפעות תאיות, תוך שימוש במתודולוגיית התמציות, באופן ניתן לשחזור וחזק.

Introduction

תאימות ביולוגית יכולה להיות מוגדרת כיכולת של חומר לשלב רקמות ולגרום לתגובה טיפולית חיובית, ללא נזקים מקומיים וסיסטמיים ^1,2,3. הערכת תאימות ביולוגית חיונית לפיתוח כל חומר המיועד לשימוש רפואי. לכן, פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית ומקיפה לכל חוקר השואף לפתח ביו-חומרים חדשים או לחקור יישומים חדשים לביו-חומרים קיימים.

בדיקות ציטוטוקסיות במבחנה נמצאות בשימוש נרחב כשלב הראשון להערכת תאימות ביולוגית, באמצעות תרביות תאים ראשוניות או קווי תאים. התוצאות מהוות אינדיקטור ראשון ליישום קליני פוטנציאלי. מלבד היותה חיונית לפיתוח ביו-חומרים, בדיקה זו היא חובה כדי לעמוד בתקנות הנוכחיות להחדרת שוק, מהרגולטורים של EUA והאיחוד האירופי (אישור FDA ו- CE) 4,5,6,7,8. יתר על כן, בדיקות סטנדרטיות במחקר ביו-רפואי מספקות יתרון משמעותי במונחים של שחזור והשוואת תוצאות ממחקרים שונים על ביו-חומרים או מכשירים דומים⁹.

הנחיות ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) נמצאות בשימוש נרחב על ידי מעבדות מסחריות, רגולטוריות ואקדמיות עצמאיות רבות לבדיקת חומרים באופן מדויק וניתן לשחזור. ISO 10993-5 מתייחס להערכת ציטוטוקסיות חוץ גופית ודוחות ISO 10993-12 להכנת דגימה^10,11. לבדיקות ביו-חומרים ניתנות שלוש קטגוריות, שייבחרו בהתאם לסוג החומר, רקמות המגע ומטרת הטיפול: תמציות, מגע ישיר ומגע עקיף 8,11,12,13. תמציות מתקבלות על ידי העשרת מדיום תרבית תאים עם החומר הביולוגי. עבור בדיקות מגע ישיר, החומר הביולוגי ממוקם ישירות על תרביות התא, ובמגע עקיף, הדגירה עם התאים מתבצעת מופרדת על ידי מחסום, כגון ג'ל אגרוז¹¹. בקרות מתאימות הן חובה, ויש לבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים 5,8,10,11,14.

זה קריטי לדמות או להגזים בתנאים קליניים כדי לקבוע את הפוטנציאל ציטוטוקסי. במקרה של בדיקת תמציות, שטח הפנים של החומר;  הנפח הבינוני; המדיום וה- pH החומרי; מסיסות החומר, האוסמולריות ויחס הדיפוזיה; ותנאי המיצוי כגון תסיסה, טמפרטורה וזמן משפיעים על מעשרת המדיה⁵.

המתודולוגיה מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של ציטוטוקסיות של מספר פורמולציות פרמצבטיות, הן מוצקות והן נוזליות. ניתן לבצע מספר בדיקות, כגון בדיקת ספיגה אדומה ניטרלית, בדיקת היווצרות מושבה, בדיקת MTT ובדיקת XTT 5,10,14.

רוב מחקרי הערכת ציטוטוקסיות שפורסמו משתמשים בבדיקות פשוטות יותר, כלומר MTT ו- XTT, המספקות מידע מוגבל. הערכת תאימות ביולוגית צריכה לכלול לא רק הערכה של ציטוטוקסיות אלא גם פעילות ביולוגית של חומר בדיקה נתון², כפי שפרוטוקול זה מאשר. יש להשתמש בקריטריונים נוספים להערכה כאשר הם מוצדקים ומתועדים. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לספק מדריך מקיף, המפרט סדרה של שיטות להערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרית. חוץ מזה, הערכה של תהליכים תאיים שונים, כלומר סוג של מוות התא, מורפולוגיה של התא, תפקוד התא בסינתזה של חלבונים ספציפיים, וייצור רקמות ספציפיות, מתוארים.