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Resumo

Esta metodologia visa avaliar a citotoxicidade de biomateriais através da preparação de extratos solúveis, utilizando ensaios de viabilidade e análise fenotípica, incluindo citometria de fluxo, RT-PCR, imunocitoquímica e outras técnicas de biologia celular e molecular.

Resumo

Os biomateriais entram em contato direto ou indireto com os tecidos humanos, tornando importante avaliar sua citotoxicidade. Essa avaliação pode ser realizada por diversos métodos, mas existe uma grande discrepância entre as abordagens utilizadas, comprometendo a reprodutibilidade e a comparação entre os resultados obtidos. Neste trabalho, propomos um protocolo para avaliar a citotoxicidade de biomateriais utilizando extratos solúveis, que utilizamos para biomateriais odontológicos. O preparo dos extratos é detalhado, desde a produção dos pellets até sua extração em meio de cultura. A avaliação da citotoxicidade dos biomateriais é baseada na atividade metabólica pelo ensaio de MTT, viabilidade celular pelo ensaio de Sulforhodamina B (SBR), perfil de morte celular por citometria de fluxo e morfologia celular por May-Grünwald Giemsa. Além da avaliação da citotoxicidade, um protocolo para avaliar a função celular é descrito com base na expressão de marcadores específicos avaliados por imunocitoquímica e PCR. Este protocolo fornece um guia abrangente para avaliação da citotoxicidade de biomateriais e efeitos celulares, utilizando a metodologia de extratos, de forma reprodutível e robusta.

Introdução

A biocompatibilidade pode ser definida como a capacidade de um material integrar tecidos e induzir uma resposta terapêutica favorável, livre de danos locais e sistêmicos 1,2,3. A avaliação da biocompatibilidade é crucial para o desenvolvimento de qualquer material destinado a uso médico. Portanto, este protocolo fornece uma abordagem sistemática e abrangente para todo pesquisador com o objetivo de desenvolver novos biomateriais ou estudar novas aplicações para biomateriais existentes.

Testes de citotoxicidade in vitro são amplamente utilizados como primeira fase para avaliação da biocompatibilidade, utilizando culturas primárias de células ou linhagens celulares. Os resultados constituem um primeiro indicador de potencial aplicação clínica. Além de serem vitais para o desenvolvimento de biomateriais, esses testes são obrigatórios para atender às regulamentações vigentes para introdução no mercado, provenientes dos reguladores dos EUA e da UE (certificação FDA e CE)4,5,6,7,8. Além disso, testes padronizados em pesquisas biomédicas proporcionam uma vantagem significativa em termos de reprodutibilidade e comparação de resultados de diferentes estudos sobre biomateriais ou dispositivossemelhantes9.

As diretrizes da International Organization for Standardization (ISO) são amplamente utilizadas por vários laboratórios comerciais, regulatórios e acadêmicos independentes para testar materiais de maneira precisa e reprodutível. A ISO 10993-5 refere-se à avaliação da citotoxicidade in vitro e a ISO 10993-12 reporta à preparação daamostragem10,11. Para os testes de biomateriais são apresentadas três categorias, a serem selecionadas de acordo com o tipo de material, tecidos em contato e objetivo do tratamento: extratos, contato direto e contato indireto 8,11,12,13. Os extratos são obtidos pelo enriquecimento de um meio de cultura celular com o biomaterial. Para os testes de contato direto, o biomaterial é colocado diretamente sobre as culturas celulares e, no contato indireto, é realizada a incubação com as células separadas por uma barreira, como um gel de agarose11. Controles adequados são obrigatórios, e um mínimo de três experimentos independentes devem ser realizados 5,8,10,11,14.

É fundamental simular ou exagerar as condições clínicas para determinar o potencial citotóxico. No caso de ensaios de extratos, a área superficial do material;  o volume médio; o pH do meio e do material; a solubilidade, osmolaridade e razão de difusão do material; e as condições de extração, como agitação, temperatura e tempo, influenciam o enriquecimento dos meios5.

A metodologia permite a avaliação quantitativa e qualitativa da citotoxicidade de diversas formulações farmacêuticas, sólidas e líquidas. Vários ensaios podem ser realizados, como o teste de captação do vermelho neutro, o teste de formação de colônias, o ensaio de MTT e o ensaio de XTT 5,10,14.

A maioria dos estudos de avaliação de citotoxicidade publicados utiliza ensaios mais simples, nomeadamente MTT e XTT, que fornecem informações limitadas. A avaliação da biocompatibilidade não deve envolver apenas a avaliação da citotoxicidade, mas também da bioatividade de um determinado material de teste2, como endossa este protocolo. Devem ser utilizados critérios de avaliação adicionais sempre que justificados e documentados. Assim, este protocolo visa fornecer um guia abrangente, detalhando um conjunto de métodos para a avaliação da citotoxicidade de biomateriais. Além disso, a avaliação de diferentes processos celulares, nomeadamente o tipo de morte celular, morfologia celular, função celular na síntese de proteínas específicas e produção tecidual específica, são descritas.

Protocolo

1. Preparação dos pellets

  1. Prepare os moldes de policloreto de vinila (PVC) realizando furos circulares de dimensões conhecidas em placas de PVC.
    OBS: As molduras de PVC podem ser confeccionadas de diferentes tamanhos. Calcular a superfície de contato dos moldes de PVC, utilizando a fórmula A= h(2πr)+2πr2 (r: raio do cilindro; h: altura do cilindro).
  2. Preparar o biomaterial a ser testado de acordo com as instruções do fabricante e o mais próximo possível do início do experimento.
    NOTA: Para a preparação de biomateriais de formulação pasta/pasta, uma quantidade adequada de pasta base e catalisador são misturados manualmente com uma espátula de mistura. Para outros materiais à base de formulações líquidas e em pó, deve-se realizar a espatulação manual ou a mistura mecânica com vibração, seguindo as instruções do fabricante ou as adequadas para novos materiais. Para materiais líquidos, esta etapa não é necessária. Inicie o protocolo na etapa 2.
  3. Coloque o biomaterial sobre os moldes com uma espátula e deixe-os fixos no momento adequado.
    NOTA: O tempo de presa e as condições de ajuste dos biomateriais devem seguir as instruções do fabricante ou as adequadas para novos materiais.
  4. Após a colocação, retire os pellets do biomaterial dos moldes de PVC e coloque-os em um recipiente (uma placa de 6 poços ou uma placa de Petri pode ser usada).
  5. Esterilize os pellets colocando-os sob uma lâmpada de luz ultravioleta (UV) por 20 minutos para cada lado.

2. Obtenção dos extratos dos biomateriais

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados sob rigorosas condições estéreis.

  1. Determinar o número necessário de pellets calculando a superfície dos pellets com base na fórmula descrita no ponto 1.1.
    NOTA: Como valor de referência, a área de superfície de contato de 250 mm2/mL11,15 é obtida pela adição de 9 pastilhas (r 3 mm x h 1,5 mm) por mL do meio.
  2. Preparar os extratos solúveis (extrato enriquecido com o biomaterial).
    1. Colocar os pellets num tubo de 50 ml e adicionar o correspondente do meio de cultura celular. Coloque os tubos por 24 horas na incubadora a 37°, em rotação constante.
      Observação : use o meio de cultura de células apropriado para as culturas de células.
    2. Após 24 horas, retire os tubos da incubadora. Neste ponto, os extratos correspondem a uma concentração de 1/1 ou 100%.
    3. Fazer diluições do extrato por adição sequencial de volumes iguais de meio condicionado para meio de cultura celular.
      NOTA: Nenhum ajuste de pH deve ser feito na mídia.
      1. Adicionar 1 mL de meio de cultura a 1 mL de extrato a 100% para obter um extrato a 50%. Adicionar 1 mL de meio de cultura a 1 mL de extrato a 50% para obter um extrato a 25%, e assim sucessivamente (Figura 1).
        NOTA: Use as concentrações consideradas relevantes para cada composto.

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Figura 1: Esquema de preparação e diluições dos extractos solúveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Incubação celular com extratos dos biomateriais

  1. Preparar uma suspensão celular e colocá-la em um recipiente celular adequado, como uma placa multipoço, de acordo com o número de células necessárias para os experimentos.
    1. Iniciar com um frasco das células desejadas com 80% a 90% de confluência.
    2. Eliminar o meio de cultura celular, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e destacar as células com tripsina-EDTA (1 a 2 mL para um frasco de cultura celular de 75cm2 ).
    3. Adicionar o meio de cultura celular (2 a 4 mL para um balão de cultura de célulasde 75 cm 2 ), transferir a suspensão celular para um tubo e centrifugar a 200 x g por 5 min.
    4. Suspender o pellet em um volume conhecido de meio de cultura celular.
      NOTA: Este protocolo é projetado para o uso de culturas de células aderentes; no entanto, adaptações simples podem ser feitas para trabalhar com culturas de células em suspensão.
    5. Conte as células no hemocitômetro e calcule a concentração celular da suspensão celular.
    6. Suspender a quantidade determinada de suspensão celular em meio de cultura e transferir para placas multipoço. Como valor de referência para densidade de semeadura, considere 5 – 20 x 105 células/cm2.
      NOTA: O número adequado de células deve ser calculado de acordo com o tipo de célula e as características da célula, ou seja, o tempo de duplicação celular.
  2. Incubar as células por 24 horas para permitir a adesão celular.
  3. Após este período, administrar os extratos solúveis nas placas de cultura.
    1. Aspirar o meio de cultura celular.
    2. Adicionar os extratos dos biomateriais a cada poço, de acordo com a sequência de concentrações, conforme descrito anteriormente. Adicionar meio de cultura de células fresco aos poços controle.
    3. Incubar as placas por 24 h ou mais.
      OBS: Controles negativos devem ser realizados em cada ensaio, correspondentes às células não tratadas, mantidas no meio de cultura. Os tempos de incubação podem ser selecionados de acordo com os objetivos do estudo.

4. Avaliação da atividade metabólica

  1. Após a incubação das células com os extratos dos biomateriais, aspirar o meio das placas e lavar cada poço PBS.
  2. Colocar, em cada poço, o volume adequado de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) 0,5 mg/mL preparado em PBS, pH 7,4.
  3. Incubar as placas por 4 h ou durante a noite no escuro a 37 ° C.
  4. Para solubilizar os cristais de formazana obtidos, adicione o volume adequado de solução de ácido clorídrico 0,04 M em isopropanol a cada poço e agite as placas por 30 minutos.
    OBS: Ajustar a quantidade de MTT e isopropanol de acordo com o tamanho dos poços.
  5. Mexa e homogeneize o conteúdo de cada poço, se necessário, pipetando para cima e para baixo até que nenhum cristal seja visto.
  6. Quantificar a absorbância a um comprimento de onda de 570 nm com um filtro de referência de 620 nm, no espectrofotômetro.
  7. Para calcular a atividade metabólica, dividir a absorbância das células tratadas pela absorbância das culturas controle. Para obter valores percentuais, multiplique por 100.

5. Avaliação da morte celular

NOTA: Para efectuar esta avaliação deve ser utilizado um mínimo de 10a 6 células por condição.

  1. Utilizar tubos de centrífuga devidamente identificados, de acordo com as condições a serem avaliadas.
  2. Após a incubação das células com os extratos dos biomateriais, coletar o meio de cultura para o respectivo tubo.
  3. Separar as células e adicionar a suspensão celular aos respectivos tubos.
  4. Concentrar as suspensões celulares por centrifugação a 120 x g durante 5 minutos.
  5. Lave os pellets com PBS. Remova o PBS por centrifugação a 1.000 x g por 5 minutos.
  6. Adicionar 1 mL de PBS e transferir os pellets de células para tubos de citometria identificados.
  7. Remova o PBS por centrifugação a 1.000 x g por 5 minutos.
  8. Incubar com 100 μL de tampão de ligação (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl e 0,25 mM CaCl2)16, e deixar as células descansarem por cerca de 15 minutos para recuperação da membrana celular.
  9. Adicionar 2,5 μL de Anexina-V fluorescente e 1 μL de iodeto de propídio durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
  10. Após a incubação, adicionar 400 μL de PBS e analisar no citômetro. Para a análise e quantificação das informações utilizar softwares apropriados.
  11. Apresentar resultados em porcentagem de células vivas, apoptose, apoptose/necrose tardia e necrose.

6. Avaliação morfológica

  1. Selecione o tamanho apropriado das lamínulas de vidro esterilizado que se encaixam dentro da placa multipoço.
  2. Coloque cada lâmina em um poço usando pinças estéreis.
  3. Distribuir uma suspensão celular em concentração adequada nos poços e deixar pernoitar em uma incubadora a 37 °C em atmosfera umidificada com 95% de ar e 5% de CO2.
  4. Expor as culturas celulares aos extratos, conforme descrito anteriormente.
  5. Aspirar o meio e lavar com PBS.
  6. Deixe as lamínulas secar à temperatura ambiente e, em seguida, adicione um volume suficiente de solução de May-Grünwald para cobrir as lamínulas; incubar por 3 minutos.
  7. Retire o corante e lave com água destilada por 1 minuto.
  8. Retire a água e adicione um volume suficiente de solução de Giemsa para cobrir as lamínulas; Incubar por 15 minutos.
  9. Lave as tampas em água corrente.
  10. Transfira as lamínulas para um slide.
  11. Olhe sob um microscópio. Tire as fotografias com a ampliação escolhida.

7. Avaliação da função celular através da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR)

NOTA: Para efectuar esta avaliação deve ser utilizado um mínimo de 2x106 células por condição. Como exemplo, a fosfatase alcalina é apresentada como um gene de interesse para avaliação da atividade de odontoblastos. Outros genes de interesse podem ser vistos na Tabela 1.

  1. Plaqueie as células conforme descrito acima.
    NOTA: A concentração de células plaqueadas pode precisar ser ajustada, de acordo com o tipo celular e a citotoxicidade dos biomateriais em estudo.
  2. Incubar com extratos solúveis, conforme descrito acima.
  3. Separar as células para obter uma suspensão como descrito anteriormente.
  4. Lave as células duas vezes com PBS; para esta centrífuga a 200 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  5. Lisar as células suspendendo o pellet em 1 mL de solução de purificação de RNA (por exemplo, NZYol), agitação intensa e pipetagem sucessiva.
  6. Incubar as amostras durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  7. Adicionar 200 μL de clorofórmio e agitar os tubos manualmente durante 15 segundos.
  8. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
  9. Centrifugar lisa a 4°C por 15 min a 12.000 x g. Durante essa centrifugação, duas fases se originam na amostra, deixando o RNA na fase aquosa (superior).
  10. Remover a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 500 μL de isopropanol frio para precipitar o RNA.
  11. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos e centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C.
  12. Retire o sobrenadante e lave o pellet com 1 mL de etanol 75% por centrifugação a 7.500 x g por 5 minutos a 4°C.
  13. Secar o pellet à temperatura ambiente até evaporação do etanol.
  14. Suspender em água livre de RNase.
  15. Quantificar e determinar o grau de pureza das amostras utilizando espectrofotometria de absorção, nos comprimentos de onda 260 nm e 280 nm. Determinar a pureza do RNA e usar amostras com uma relação de pureza (A260/280) em torno de 2,0.
  16. Armazenar amostras a -80 ° C.
  17. Proceder à realização do RT-PCR seguindo o protocolo do fabricante17.
    OBS: De acordo com o objetivo do estudo, selecione os marcadores específicos a serem avaliados.

8. Avaliação da função celular através da identificação de proteínas

NOTA: De acordo com o objetivo do estudo, selecione as proteínas específicas a serem avaliadas. Como exemplo, a sialoproteína dentinária (DSP) é apresentada como uma proteína de interesse para a avaliação da atividade dos odontoblastos. Outras proteínas de interesse podem ser vistas na Tabela 1.

  1. Cultivar células em lamínulas e expor aos extratos, como descrito anteriormente.
  2. Lave as culturas celulares com PBS.
  3. Fixar com paraformaldeído a 3,7% durante 30 minutos à temperatura ambiente.
  4. Lave duas vezes com PBS.
  5. Permeabilizar com Triton a 0,5% em PBS por 15 minutos.
  6. Bloquear a peroxidase com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PBS por 5 minutos.
  7. Lave duas vezes com PBS.
  8. Lavar duas vezes com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5%.
  9. Bloquear culturas celulares com BSA 2% por 45 minutos.
  10. Lavar com BSA 0,5% em PBS.
  11. Incubar culturas com o anticorpo primário de acordo com a proteína selecionada por 60 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: Este protocolo utiliza o anticorpo primário DSP(M20) (1:100) e o anticorpo secundário Policlonal Coelho Anti-caprino imunoglobulinas/HRP (1:100).
  12. Lavar cinco vezes com BSA a 0,5% em PBS.
  13. Incubar com anticorpo secundário durante 90 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: Faça as diluições de anticorpos usando BSA 0,5% em PBS.
  14. Lavar cinco vezes com BSA 0,5% em PBS por 1 minuto em cada lavagem.
  15. Incubar culturas com uma mistura de substrato e cromógeno a uma concentração de 20 μL de cromogênio/mL de substrato por 25 minutos.
  16. Lavar duas vezes com BSA a 0,5% em PBS.
  17. Contracoloração com Hematoxilina por 15 minutos.
  18. Lavar com uma sequência de 0,037 mol/L de amoníaco e água destilada durante 5 minutos para remover o excesso de corante.
  19. Monte as tampas nos slides. Use glicerol como meio de montagem.
  20. Deixe secar durante a noite.
  21. Olhe sob um microscópio. Tire as fotografias com a ampliação escolhida.

9. Avaliação da mineralização pelo ensaio de Alizarin Red S

  1. Preparar uma solução de Alizarin Red S a uma concentração de 40 mM18. Mexa a solução para homogeneização durante 12 horas no escuro.
    NOTA: Para preparar 100 mL de solução de Alizarin Red S, solubilizar 1,44 g de alizarina em pó (Peso molecular: 360 g/mol) em água ultrapura, protegida da luz. Para esta solução, o valor de pH é crítico e deve estar entre 4,1 e 4,3.
  2. Incubar a cultura celular com extratos solúveis, conforme descrito acima.
  3. Lavar culturas celulares três vezes com PBS.
  4. Fixar com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  5. Lave três vezes com PBS.
  6. Manchar com solução de coloração vermelha de alizarina durante 20 minutos a 37 °C no escuro.
  7. Após a coloração, lave as placas com PBS para remover o excesso de corante.
  8. Olhe sob um microscópio. Tire as fotografias com a ampliação escolhida.
  9. Adicionar a cada poço uma solução de extração, composta por 10% (p/v) de ácido acético e 20% (p/v) de metanol, e deixar mexer por 40 minutos à temperatura ambiente.
  10. Medir a absorbância no comprimento de onda de 490 nm em espectrofotômetro19.

Resultados

Os resultados representativos referem-se ao estudo dos biomateriais odontológicos. A metodologia do extrato permite obter um perfil de citotoxicidade e função celular após exposição aos materiais dentários, quanto aos efeitos sobre a atividade metabólica (Figura 2), viabilidade celular, perfil de morte celular e morfologia celular (Figura 3), e expressão de proteínas específicas (Figura 4).

O e...

Discussão

Esse protocolo foi elaborado levando em consideração a ISO 10993-5, que se refere à avaliação da citotoxicidade in vitro de biomateriais que entram em contato com os tecidos, para avaliar a biocompatibilidade e contribuir para a reprodutibilidade dosestudos21. Essa é uma preocupação crescente na ciência, e muitos autores já estão seguindo essas recomendações no desenho experimental de seus estudos in vitro15,22,23,24,25,26,27,28.

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); O CIBB é financiado por Fundos Nacionais via FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) através do Projeto Estratégico UIDB/04539/2020 e UIDP/04539/2020 (CIBB). Agradecemos a Jacques Nör, da Faculdade de Odontologia da Universidade de Michigan, pelo fornecimento da linhagem celular MDPC-23.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibodySanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
Antibiotic antimycotic solutionSigmaA5955
BCA assayThermo Scientific23225Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albuminSigmaA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
CD133 antibodyMiteny Biotec293C3-APCAllophycocyanin (APC)
CD24 antibodyBD Biosciences658331Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibodyBiolegend103020Pacific Blue (PB)
Cell strainerBD Falcon35234040 µM
Collagenase, type IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DAB + ChromogenDakoK3468
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factorSigmaE9644
Hepes 0.01 MSigmaMFCD00006158
Fibroblast growth factor basicSigmaF0291
Giemsa Stain, modified GS-500SigmaMFCD00081642
GlycerolDakoC0563
HaemocytometerVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium SolutionGibco41400045
May-Grünwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22Human mammary adenocarcinoma cell line
MethylcelluloseAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100DakoG-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylateSigmaP3932
PutrescineSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acidJMSEINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfateSigma436143
Substrate BufferDako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
Trypan blueSigmaT8154
Trypsin-EDTASigmaT4049
β-actin antibodySigmaA5316

Referências

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