ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי

טכניקה זו מאפשרת חקירה ביו-אלקטרונית תאית עם רזולוציה מרחבית גבוהה מאוד וספציפיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית בלבד. שיטה זו מקלה על גירוי וחקירה חשמלית של תאים ומיקומים ספציפיים בתוך התאים והוא יכול להתבצע במבחנה, כמו גם בתכשירי רקמת 3D ex vivo. טכניקה זו מאפשרת חקירה ביו-אלקטרונית של זירות תאיות רבות כגון תאי לב או מוח, כמו גם את התקשורת החשמלית בין כל התאים הבלתי נרגשים שלנו.

כדי לבודד myofibroblasts מן ההשעיה cardiomyocyte myofibroblast, מראש צלחת התאים המבודדים על צלחת 100 מילימטר רקמות תרבות במשך שעה אחת, כמו cardiomyocytes צריך משטח צוואר סיבים ומטופלים לדבוק. בסוף הדגירה, לאסוף את cardiomyocyte מועשר המכיל על טבעי עבור תרבות שותף במורד הזרם. לשטוף את myofibroblasts עם DMEM כדי לחסל את כל cardiomyocytes הנותרים להאכיל את התאים עם מדיום תרבות טרי לפני יומיים עד ארבעה ימים נוספים של דגירה.

כאשר התאים מגיעים ל-80%, השתמשו בסופר יהלומים כדי לחתוך שבב של שלושה על שלושה מילימטרים מוופל עם ננו-חוטי סיליקון כימיים הגדלים על ידי אדי אדים. ולהשתמש במדפים חדים כדי לשטוף את השבבים באתנול 70%. לאחר שטיפה, מייבשים את השבבים למשך 30 דקות תחת אור אולטרה סגול במכסה המנוע של זרימה למינארית עם בטיחות ביולוגית, לפני העברת השבבים לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי.

השתמש שטיפת בינונית של תאים כדי להסיר כל אתנול שנותר, לפני sonicating את השבבים במיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי באמבט sonication במשך 1 עד 10 דקות. העל-טבעי אמור להפוך מעונן כאשר חוטי הננו משוחררים. מערבבים את ההשעיה nanowire סיליקון לתוך חמישה מיליליטר של מדיום תרבות טריים זרעים פתרון חוט ננו על המנה של myofibroblasts.

לאחר ארבע שעות באינקובטור תרבות התא, לשטוף את המנה חמש פעמים עם מדיום תרבות טריים כדי להסיר את כל nanowires uninternalized ולהמשיך להחגירה את התאים במשך שעה נוספת כדי לאפשר כל nanowires הפנימו חלקית להיות משולב לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של תוסף קולגן טרי לצלחת תחתונה מזכוכית 35 מ"מ. לאחר דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המנה עם PBS סטרילי לקצור את היברידיות myofibroblast nanowire סיליקון, עם שלושה מיליליטר של טריפסין, במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום תרבות, לשטוף במרץ על ידי צינורות ולא צנטריפוגה מעל 200 G, כדי למנוע פגיעה בתאים. לאחר מכן להשעות מחדש את כדורי התא ההיברידי במיליליטר אחד של מדיום טרי, ולזרע את התאים על צלחת תחתית זכוכית מצופה קולגן. כדי לאמת את הפנמת חוט הננו, סמן את התאים עם ציטוסול פלואורסצנטי וצבעי קרום, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ולהשתמש במיקרוסקופ קונפוקל כדי לדמיין את התאים.

כמו nanowires סיליקון הם רפלקטיביים מאוד, אור משתקף יכול לשמש במקום פלואורסצנטיות עבור הדמיה שלהם. כדי להקים סיליקון myofibroblast nanowire היברידית תרבות cardiomyocyte, זרע את המספר המתאים של כל סוג תא על צלחת זכוכית מצופה קולגן התחתון. ולתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, כדי לאפשר לתאים ליצור צמתים פער בין תאיים.

ביום הניסוי, החלף את התרבות supernatant עם מיליליטר אחד של תרבות בינוני בתוספת צבע טרי סידן רגיש, עבור דגירה 20 עד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS סטרילי, לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של פנול מחומם מראש אדום חינם DMEM. לאחר מכן אפשרו לצבע הסידן התאי לעבור דה-אסטריפיפיקציה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, לפני רכישת תמונות בסיסיות.

לפני הדמיה אופטית וגירוי, מחממים מראש מיקרו אינקובטור לח על מיקרוסקופ עם קו לייזר נאסף יחד לתוך נתיב האור, עבור הדמיה סידן וגירוי אופטי ל 37 מעלות צלזיוס ו 5% עידן בועה פחמן דו חמצני תערובת. כאשר המיקרוסקופ מוכן, מניחים את תרבות הלב-ריאה ההיברידית myofibroblast לתוך החממה מיקרו לדמיין את nanowires על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לאתר אתר גירוי מתאים. כאשר אתר זוהה, להגדיר מחדש את נתיב האור למצב פלואורסצנטי, תוך שמירה על נקודת הגירוי במיקום מוגדר מראש של חוט ננו, ולאמת את כוח הגירוי האופטימלי ואת אורך הדופק, עבור כל גודל nanowire סיליקון וסוג התא.

לרכוש הקלטה של שתיים עד עשר שניות של פעילות הסידן תאית הבסיסית, לפני גירוי חוט הננו עם פולס לייזר אחד של אחד עד 10 melowatts של כוח ומשך של 1 עד 10 אלפיות שנייה, הקלטת גל הסידן וכתוצאה מכך עוד שתיים עד 10 שניות. בסוף הניסוי להעביר את הסרטים המוקלטים של הגירוי האופטי לתוכנה המתאימה, לניתוח נוסף. באמצעות אופטיקת ניגודיות פאזה סטנדרטית, תאים confluence נצפו בקלות על ידי מיקרוסקופ אור.

Nanowires סיליקון, לעומת זאת, הם בקושי גלויים, מה שהופך את מיקומם בלתי אפשרי להגדיר על ידי שיטה זו. הטלת סופר של תמונות שדה בהירות וכהות, לעומת זאת, מאפשרת הדמיה של הסידור הגרעיני של פרי של nanowires סיליקון מחזיר אור. מיקרוסקופ קונפוקלי יכול לשמש כדי לדמיין סמן פלואורסצנטי ציטוזול מוכתם קרום פלזמה, מה שהופך את המיקום תאי של nanowires סיליקון ברור יותר.

באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית, ניתן להשיג תמונת שדה בהיר כדי לזהות את המיקום של nanowire סיליקון להיות מגורה. לאחר מכן ניתן לרכוש סרטון בסיסי קצר של הקרדיומיוציטים המכים באופן ספונטני ואת מיופיברובלסטים המנוחים. לאחר הגירוי, ניתן לתעד את התפשטות הסידן בתוך התרבות הקובית.

הזמן שבו התאים השונים מתרגשים יכול להיקבע על ידי הנקודה שבה השינוי בזרימה האופטית הממוצעת מגיע למקסימום. לאחר מכן ניתן לחשב את הזרימה האופטית כדי לסייע בזיהוי זמן ההפעלה בתוך כל אזור תא. ניתן לקבוע את המהירויות התאיות עבור כל תא באמצעות גרפי ח'ימה, כאשר שיפוע הקו מייצג את ההופכי של מהירות ההפצה התאית.

לדוגמה, כאן, ניתן לראות סיכום של המהירויות הבין-תאיות והמעקביות השונות הנמדדות עבור אינטראקציות התאים בתוך תרבות-משנה אחת. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למחקרים in vivo על ידי הזרקת התא סיליקון היברידיות ישירות לתוך הרקמה באמצעות 3D אקס ויוו ההכנות ללמוד את חברת החשמל in vivo.