Questa tecnica consente l'interrogatorio bioelettrico intracellulare ad altissima risoluzione spaziale e specificità cellulare utilizzando solo microscopia ottica standard. Questo metodo facilita la stimolazione e l'interrogazione elettrica di cellule e posizioni specifiche all'interno delle cellule e può essere eseguito in vitro e in preparati tissutali ex vivo 3D. Questa tecnica consente l'indagine bio-elettronica di molte arene cellulari come cellule cardiache o cerebrali, così come la comunicazione elettrica tra tutte le nostre cellule non eccitabili.
Per isolare i miofibroblasti da una sospensione cardiomiocita del miofibroblasto, pre-placcare le cellule isolate su un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri per un'ora, poiché i cardiomiociti hanno bisogno di una superficie scollata e trattata in fibra per aderire. Al termine dell'incubazione, raccogliere il cardiomiocita arricchito contenente supernatante per la cocoltura a valle. Risciacquare i miofibroblasti con DMEM per eliminare eventuali cardiomiociti rimanenti e nutrire le cellule con un mezzo di coltura fresco prima di altri due o quattro giorni di incubazione.
Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, utilizzare uno scriba di diamante per tagliare un chip di tre per tre millimetri da un wafer con nanofili di silicio coltivati a deposizione chimica di vapore. E utilizzare forcep affilati per risciacquare i trucioli in 70% di etanolo. Dopo il risciacquo, asciugare ad aria i trucioli per 30 minuti sotto la luce ultravioletta in una cappa di flusso laminare di bio-sicurezza, prima di trasferire i trucioli in un tubo sterile di micro centrifuga.
Utilizzare un risciacquo completo del mezzo di coltura cellulare per rimuovere l'etanolo rimanente, prima di sonicare i trucioli in un millilitro di mezzo di coltura fresco in un bagno di sonicazione per uno o 10 minuti. Il supernatante dovrebbe diventare torbido man mano che i nano fili vengono rilasciati. Mescolare la sospensione nanofilo di silicio in cinque millilitri di mezzo di coltura fresco e seminare la soluzione di nano filo sul piatto dei miofibroblasti.
Dopo quattro ore nell'incubatrice di coltura cellulare, sciacquare il piatto cinque volte con un mezzo di coltura fresco per rimuovere eventuali nanofili non internalizzati e continuare a incubare le cellule per un'altra ora per consentire l'incorporamento completo di eventuali nanofili parzialmente internalizzati. Aggiungere quindi 500 microlitri di soluzione di rivestimento di collagene preparata al momento a un piatto inferiore in vetro da 35 millimetri. Dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius, sciacquare il piatto con PBS sterile e raccogliere gli ibridi di miofibroblasto nanofilo di silicio, con tre millilitri di tripside, per due minuti a 37 gradi Celsius.
Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con 10 millilitri di mezzo di coltura, risciacquare vigorosamente pipettando e non centrifugare oltre 200 G per evitare di danneggiare le cellule. Quindi sospendere di nuovo i pellet di cellule ibride in un millilitro di mezzo fresco e seminare le cellule sul piatto inferiore in vetro rivestito di collagene. Per verificare l'internalizzazione del nano filo, etichettare le cellule con citosol fluorescente e coloranti a membrana, secondo protocolli standard, e utilizzare un microscopio confocale per immagini le cellule.
Poiché i nanofili di silicio sono altamente riflettenti, la luce riflessa può essere utilizzata al posto della fluorescenza per la loro visualizzazione. Per impostare una co-coltura di cardiomiociti ibridi di nanofilo di silicio miofibroblasto, seminare il numero appropriato di ogni tipo di cellula su un piatto inferiore in vetro rivestito di collagene. E colturare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore, per permettere alle cellule di formare giunzioni intercellulari gap.
Il giorno dell'esperimento, sostituire il supernatante di coltura con un millilitro di mezzo di coltura integrato con colorante sensibile al calcio appena preparato, per un'incubazione da 20 a 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra due volte con PBS sterile, prima di trattare le cellule con un millilitro di DMEM senza fenolo prerifabburato. Quindi consentire al colorante di calcio intracellulare di subire la deesterificazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius, prima di acquisire immagini di base.
Prima dell'imaging ottico e della stimolazione, preriscaldare un micro-incubatore umidificato al microscopio con una linea laser collimata accoppiata nel percorso della luce, per l'imaging del calcio e la stimolazione ottica a 37 gradi Celsius e una miscela di anidride carbonica del 5% dell'era delle bolle. Quando il microscopio è pronto, posizionare la cocoltura di cardiomiociti ibridi del miofibroblasto nel micro incubatore e visualizzare i nanofili mediante microscopia a campo luminoso per individuare un sito di stimolazione appropriato. Quando un sito è stato identificato, riconfigurare il percorso della luce verso la modalità di fluorescenza, mantenendo il punto di stimolazione nella posizione predefinita del nanofilo, e convalidare la potenza di stimolazione ottimale e la lunghezza dell'impulso, per ogni dimensione e tipo di cella del nanofilo di silicio.
Acquisire una registrazione da due a dieci secondi dell'attività del calcio intracellulare di base, prima di stimolare il nano filo con un singolo impulso laser da uno a 10 melowatt di potenza e una durata da uno a 10 millisecondi, registrando l'onda di calcio risultante per altri due-10 secondi. Al termine dell'esperimento trasferire i filmati registrati della stimolazione ottica al programma software appropriato, per ulteriori analisi. Utilizzando l'ottica standard a contrasto di fase, le celle di confluenza sono facilmente visualizzate mediante microscopia ottica.
I nanofili di silicio, tuttavia, sono appena visibili, rendendo le loro posizioni impossibili da definire con questo metodo. La super imposizione di immagini di campo chiaro e scuro, tuttavia, consente la visualizzazione della disposizione nucleare di Perry dei nanofili di silicio riflettenti leggeri. La microscopia confocale può essere utilizzata per visualizzare il citosol colorato marcatore fluorescente e le membrane plasmatiche, rendendo più evidente la posizione intracellulare dei nanofili di silicio.
Utilizzando la microscopia standard, è possibile ottenere un'immagine a campo luminoso per identificare la posizione del nanofilo di silicio da stimolare. È quindi possibile acquisire un breve video di base dei cardiomiociti che battono spontaneamente e dei miofibroblasti a riposo. Dopo la stimolazione, la propagazione del calcio all'interno della co-coltura può essere registrata.
Il momento in cui le diverse cellule si eccitano può essere determinato dal punto in cui il cambiamento nel flusso ottico medio raggiunge il suo massimo. Il flusso ottico può quindi essere calcolato per aiutare nell'identificazione del tempo di attivazione all'interno di ciascuna regione cellulare. Le velocità intracellulari possono essere determinate per ogni cellula usando grafi di Khaimah, con la pendenza della linea che rappresenta l'inverso della velocità di propagazione intracellulare.
Ad esempio, qui si può osservare un riassunto delle diverse velocità inter e intracellulari misurate per le interazioni cellulari all'interno di una singola co-coltura. Questo metodo può essere utilizzato per studi in vivo iniettando la cellula ibridi di silicio direttamente nel tessuto e utilizzando preparati ex vivo 3D per studiare l'azienda elettrica in vivo.
