Diese Technik ermöglicht intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit extrem hoher räumlicher Auflösung und Zellspezifität nur mit standardoptischer Mikroskopie. Diese Methode erleichtert die Stimulation und elektrische Abfrage von Zellen und bestimmten Positionen innerhalb der Zellen und kann sowohl in vitro als auch in 3D-Ex-vivo-Gewebepräparaten durchgeführt werden. Diese Technik ermöglicht die bioelektronische Untersuchung vieler zellulärer Arenen wie Herz- oder Gehirnzellen sowie die elektrische Kommunikation zwischen all unseren nicht erregbaren Zellen.
Um Myofibroblasten von einer Myofibroblasten-Kardiomyozytensuspension zu isolieren, verfestigen Sie die isolierten Zellen für eine Stunde auf eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale, da Kardiomyozyten eine fasergebundene und behandelte Oberfläche benötigen, um haften zu können. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die angereicherte Kardiomyozyten mit Überstand für nachgeschaltete Co-Kultur. Spülen Sie die Myofibroblasten mit DMEM, um alle verbleibenden Kardiomyozyten zu beseitigen und die Zellen mit frischem Kulturmedium zu füttern, bevor weitere zwei bis vier Tage inkubiert werden.
Wenn die Zellen 80 % Konfluenz erreichen, verwenden Sie einen Diamantschreiber, um einen drei mal drei Millimeter großen Chip aus einem Wafer mit chemischen Dampfabscheidungs-Silizium-Nanodrähten zu schneiden. Und verwenden Sie scharfe Zangen, um die Chips in 70% Ethanol zu spülen. Nach dem Spülen die Chips 30 Minuten unter ultraviolettem Licht in einer biosicherheitslaminiaren Durchflusshaube lufttrocknen, bevor die Chips in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen werden.
Verwenden Sie ein komplettes Zellkulturmedium Spülen, um alle verbleibenden Ethanol zu entfernen, bevor Sie die Chips in einem Milliliter frischem Kulturmedium in einem Beschallungsbad für ein bis 10 Minuten beschallen. Der Überstand sollte trüb werden, wenn die Nanodrähte freigesetzt werden. Mischen Sie die Silizium-Nanodrahtsuspension in fünf Milliliter frisches Kulturmedium und säen Sie die Nanodrahtlösung auf die Schale von Myofibroblasten.
Nach vier Stunden im Zellkultur-Inkubator spülen Sie das Gericht fünfmal mit frischem Kulturmedium ab, um nicht internalisierte Nanodrähte zu entfernen und die Zellen für eine weitere Stunde zu bebrüten, damit alle teilweise verinnerlichten Nanodrähte vollständig integriert werden können. Als nächstes 500 Mikroliter frisch zubereitete Kollagenbeschichtungslösung zu einer 35 Millimeter Glasbodenschale hinzufügen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius spülen Sie die Schale mit sterilem PBS ab und ernten sie die Silizium-Nanodraht-Myofibroblast-Hybriden mit drei Milliliter Trypsin zwei Minuten bei 37 Grad Celsius.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter Kulturmedium, spülen Sie kräftig durch Pipettieren und zentrieren Sie nicht über 200 G, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden. Dann die Hybridzellpellets in einem Milliliter frischem Medium wieder aufhängen und die Zellen auf der kollagenbeschichteten Glasbodenschale säen. Um die Verinnerlichung des Nanodrahtes zu überprüfen, beschriften Sie die Zellen gemäß den Standardprotokollen mit fluoreszierendem Zytosol und Membranfarbstoffen, und verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Zellen abzubilden.
Da Silizium-Nanodrähte stark reflektierend sind, kann reflektiertes Licht anstelle von Fluoreszenz für ihre Visualisierung verwendet werden. Um eine Myofibroblast-Silizium-Nanodraht-Hybrid-Kardiomyozyten-Kokultur einzurichten, säen Sie die entsprechende Anzahl jedes Zelltyps auf eine kollagenbeschichtete Glasbodenschale. Und kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden, damit die Zellen interzelluläre Spaltverbindungen bilden können.
Ersetzen Sie am Tag des Experiments den Kulturüberstand durch einen Milliliter Kulturmedium, ergänzt durch frisch zubereiteten kalziumempfindlichen Farbstoff, für eine 20-30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Platte zweimal mit sterilem PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem phenolrot-freiem DMEM behandeln. Dann lassen Sie den intrazellulären Kalziumfarbstoff 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius entestert werden, bevor sie Grundbilder aufnehmen.
Vor der optischen Bildgebung und Stimulation einen befeuchteten Mikro-Inkubator auf einem Mikroskop mit einer kollimierten Laserlinie, die in den Lichtpfad gekoppelt ist, für die Kalzium-Bildgebung und optische Stimulation auf 37 Grad Celsius und ein 5%Blasen-Ära-Kohlendioxidgemisch vorheizen. Wenn das Mikroskop bereit ist, legen Sie die Myofibroblast-Hybrid-Kardiomyozyten-Kokultur in den Mikro-Inkubator und visualisieren Sie die Nanodrähte durch Hellfeldmikroskopie, um eine geeignete Stimulationsstelle zu lokalisieren. Wenn ein Standort identifiziert wurde, konfigurieren Sie den Lichtpfad in den Fluoreszenzmodus um, wobei Sie den Stimulationspunkt an der vordefinierten Position des Nanodrahtes beibehalten und die optimale Stimulationsleistung und Pulslänge für jede Silizium-Nanodrahtgröße und jeden Zelltyp validieren.
Erwerben Sie eine zwei- bis zehnsekunden lange Aufzeichnung der intrazellulären Ausgangsaktivität, bevor Sie den Nanodraht mit einem einzigen Laserpuls von einem bis zehn Melowatt Leistung und einer Dauer von ein bis zehn Millisekunden stimulieren und die resultierende Kalziumwelle für weitere zwei bis zehn Sekunden aufzeichnen. Übertragen Sie am Ende des Experiments die aufgenommenen Filme der optischen Stimulation zur zusätzlichen Analyse an das entsprechende Softwareprogramm. Mit Standardphasenkontrastoptiken lassen sich Konfluenzzellen durch Lichtmikroskopie leicht betrachten.
Silizium-Nanodrähte sind jedoch kaum sichtbar, so dass ihre Standorte mit dieser Methode nicht definiert werden können. Die Überlagerung von Licht- und Dunkelfeldbildern ermöglicht jedoch die Visualisierung der Kernanordnung der lichtreflektierenden Silizium-Nanodrähte. Die konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um fluoreszierende Marker-gefärbte Zytosol- und Plasmamembranen zu visualisieren, wodurch die intrazelluläre Position der Silizium-Nanodrähte deutlicher wird.
Mit Hilfe der Standardmikroskopie kann ein helles Feldbild erhalten werden, um die Position des zu stimulierenden Silizium-Nanodrahtes zu identifizieren. Ein kurzes Basisvideo der spontan schlagenden Kardiomyozyten und der ruhenden Myofibroblasten kann dann erworben werden. Nach der Stimulation kann die Kalziumausbreitung innerhalb der Kokultur aufgezeichnet werden.
Die Zeit, zu der die verschiedenen Zellen angeregt werden, kann durch den Punkt bestimmt werden, an dem die Veränderung des durchschnittlichen optischen Flusses ihr Maximum erreicht. Der optische Fluss kann dann berechnet werden, um bei der Identifizierung des Zeitpunkts der Aktivierung innerhalb jeder Zellregion zu helfen. Die intrazellulären Geschwindigkeiten können für jede Zelle mit Khaimah-Graphen bestimmt werden, wobei die Steigung der Linie die Umkehrung der intrazellulären Ausbreitungsgeschwindigkeit darstellt.
Hier kann beispielsweise eine Zusammenfassung der verschiedenen inter- und intrazellulären Geschwindigkeiten beobachtet werden, die für die Zellinteraktionen innerhalb einer einzelnen Kokultur gemessen wurden. Diese Methode kann für In-vivo-Studien verwendet werden, indem die Zell-Silizium-Hybride direkt in das Gewebe injiziert werden und 3D-Ex-vivo-Präparate verwendet werden, um das in vivo elektrische Unternehmen zu untersuchen.
