Этот метод позволяет внутриклеточный биоэлектрический допрос с чрезвычайно высоким пространственным разрешением и клеточной специфичностью, используя только стандартную оптическую микроскопию. Этот метод облегчает стимуляцию и электрический допрос клеток и конкретных мест в клетках и может быть выполнен в пробирке, а также в 3D ex vivo ткани препаратов. Этот метод позволяет биоэлектронной исследования многих клеточных аренах, таких как сердечные или клетки мозга, а также электрической связи между всеми нашими невозбудимых клеток.
Чтобы изолировать миофибробласты от миофибробласта кардиомиоцитов подвески, предварительно пластины изолированных клеток на 100 миллиметров ткани культуры блюдо в течение одного часа, как кардиомиоциты нуждаются в волоконной шее и обработанной поверхности придерживаться. В конце инкубации соберите обогащенный кардиомиоцит, содержащий супернатант для совместной культуры ниже по течению. Промыть миофибробласты с DMEM для устранения любых оставшихся кардиомиоцитов и кормить клетки свежей среде культуры до дополнительных двух-четырех дней инкубации.
Когда клетки достигают 80%-ного слияния, используйте алмазного писца, чтобы вырезать чип три на три миллиметра из пластины с химическими парами, выращенными кремниевыми нанопроводами. И использовать острые миппы для полоскания чипов в 70% этанола. После полоскания, воздух сухой чипов в течение 30 минут под ультрафиолетовым светом в био-безопасности ламинарного потока капот, прежде чем передать чипы в стерильной микро центрифуги трубки.
Используйте полную клеточной культуры среднего полоскания, чтобы удалить все оставшиеся этанола, прежде чем sonicating чипов в один миллилитр свежей среды культуры в sonication ванной в течение одного до 10 минут. Супернатант должен стать облачным, как нано провода освобождены. Смешайте подвеску кремния nanowire в пять миллилитров свежей среды культуры и семян нано проволоки раствор на блюдо миофибробластов.
После четырех часов в инкубаторе клеточной культуры, промойте блюдо пять раз со свежей средой культуры, чтобы удалить любые неинтернализованные нанопроводы и продолжать инкубировать клетки в течение еще одного часа, чтобы любые частично интернализированные нанопроводы были полностью включены. Затем добавьте 500 микролитров свежеприготовленного раствора коллагенового покрытия в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку. После одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию, промыть блюдо стерильным PBS и урожай кремния nanowire миофибробласт гибридов, с тремя миллилитров трипсина, в течение двух минут при 37 градусов по Цельсию.
Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с 10 миллилитров культуры среды, промыть энергично трубопроводов и не центрифуги более 200 G, чтобы избежать повреждения клеток. Затем повторно приостановить гибридные гранулы клеток в один миллилитр свежей среды, и семена клеток на коллагена покрытием стекла нижней блюдо. Для проверки интернализации нанопровода, этикетка клеток с флуоресцентными цитозолами и мембранными красителями, в соответствии со стандартными протоколами, и использовать конфокальный микроскоп для изображения клеток.
Поскольку кремниевые нанопроводы очень отражающие, отраженный свет может быть использован вместо флуоресценции для их визуализации. Чтобы создать миофибробласт кремния nanowire гибридных кардиомиоцитов совместно культуры, семена соответствующее количество каждого типа клеток на коллаген покрытием стекла нижней блюдо. И культуры клеток при 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов, чтобы клетки образуют межклеточный разрыв соединений.
В день эксперимента замените культурный супернатант одним миллилитром среды культуры, дополненным свежеприготовленным кальциевым чувствительным красителем, на инкубацию от 20 до 30 минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть пластину два раза с стерильными PBS, прежде чем лечить клетки с одним миллилитр предварительно разогретого фенола красный свободный DMEM. Затем позвольте внутриклеточному красителю кальция пройти деэстерификацию в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем получить исходные изображения.
Перед оптической визуализацией и стимуляцией разогрейте увлажненный микро-инкубатор на микроскопе с коллимированной лазерной линией, соединенной в световой путь, для визуализации кальция и оптической стимуляции до 37 градусов по Цельсию и смеси двуокиси углерода эпохи 5%bubble. Когда микроскоп будет готов, поместите миофибробласт гибридных кардиомиоцитов совместно культуры в микро-инкубатор и визуализировать нанопроводов с помощью яркой микроскопии поля, чтобы найти соответствующий сайт стимуляции. Когда сайт был идентифицирован, перенастроить путь света в режим флуоресценции, сохраняя при этом точку стимуляции в заранее определенном месте нано провода, и проверить оптимальную мощность стимуляции и длину импульса, для каждого кремния нанопровод размер и тип клетки.
Приобрети двух-десятисекундную запись базовой внутриклеточной активности кальция, прежде чем стимулировать нанопровод одним лазерным импульсом от одного до 10 меловатт мощности и продолжительностью от одной до 10 миллисекунд, записывая полученную волну кальция в течение еще двух-десяти секунд. В конце эксперимента перенесите записанные фильмы оптической стимуляции в соответствующую программу, для дополнительного анализа. Используя стандартную фазовую контрастную оптику, ячейки слияния легко просматриваются с помощью световой микроскопии.
Силиконовые нанопроводы, однако, едва заметны, что делает их расположение невозможно определить с помощью этого метода. Супер наложение световых и темных полевых изображений, однако, позволяет визуализировать перри ядерного расположения светоотражающих кремниевых нанопроводов. Конфокальную микроскопию можно использовать для визуализации флуоресцентного маркера окрашенных цитозоловых и плазменных мембран, что делает внутриклеточное расположение кремниевых нанопроводов более очевидным.
Используя стандартную микроскопию, можно получить яркое полевое изображение для определения местоположения кремниевого нанопровода, который будет стимулироваться. Краткое базовое видео спонтанно избиения кардиомиоцитов и отдыха миофибробластов могут быть приобретены. После стимуляции можно фиксировали размножение кальция в рамках совместной культуры.
Время возбуждения различных клеток может определяться точкой, в которой изменение среднего оптического потока достигает своего максимума. Оптический поток может быть рассчитан, чтобы помочь в идентификации времени активации в каждой области ячейки. Внутриклеточные скорости могут быть определены для каждой ячейки с помощью графиков Хаймы, при этом наклон линии представляет обратную скорость внутриклеточного распространения.
Например, здесь можно наблюдать резюме различных межклеточных и внутриклеточных скоростей, измеренных для клеточных взаимодействий в рамках одной совместной культуры. Этот метод может быть использован для исследований in vivo путем введения гибридов кремния клеток непосредственно в ткани и с помощью 3D ex vivo препаратов для изучения in vivo электрической компании.
