As inflorescências jovens como explantamento para a produção de calos são importantes para estabelecer uma transformação genética rápida e eficiente e um método de regeneração para revelar a função genética, bem como para a melhoria das culturas. Inflorescências jovens como explant para a produção de calos são importantes para estabelecer uma rápida e eficiente transformação genética e o método de regeneração para revelar a função genética. A demonstração em vídeo desta técnica ajudará o espectador a entender o processo de manutenção dos materiais para produzir aquele alinhado transgênico desejado sem perder tempo e esforço.
Comece coletando inflorescências de arroz jovem do campo de pastagem ou de uma estufa na fase de meiose, certificando-se de que eles estão cobertos com a baia de folhas. Limpe cada inflorescência com um cotonete de 70% de álcool e deixe secar antes de cortar. Leve a inflorescência para um banco de laboratório estéril e corte-a em pequenos pedaços com uma tesoura esterilizada, em seguida, transfira as estacas para uma placa de Petri contendo meio NBD2.
Incubar a placa no escuro a 26 graus Celsius por 10 a 14 dias para induzir calo. Para realizar a transformação, transfira uma única colônia da placa EB branca com antibióticos seletivos para cinco mililitros de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mililitros. Agite o tubo em um agitador orbital a 250 vezes g e 25 a 28 graus Celsius até que as bactérias cresçam para um OD 600 de 0,5.
Adicione um mililitro de suspensão bacteriana a 100 mililitros de meio YEB com os mesmos antibióticos seletivos em um frasco cônico de 250 mililitros e agite o frasco em um agitador orbital a 250 vezes g e 28 graus Celsius por quatro horas. Centrifugar a cultura a 4.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente para coletar as bactérias. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com a média AAM AS, em seguida, dilua a suspensão para um OD 600 de 0,4.
Após a incubação, colete cerca de 150 cali embriogênico amarelo claro saudável em um frasco estéril de 150 mililitros. Adicione 50 a 75 mililitros da suspensão celular bacteriana no frasco e adicione 10 a 25 mililitros de meio AAM AS fresco para imergir o cali por 10 a 20 minutos, tremendo ocasionalmente. Despeje a suspensão bacteriana do frasco cuidadosamente e seque o caldo com papel filtro estéril, em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD AS e cubra-os com papel filtro.
Incubar o cali a 25 a 28 graus Celsius no escuro por três dias, verificando-os quanto o crescimento bacteriano. Após três dias de co-cultivo, transfira o cali para uma placa de Petri estéril usando papel filtro, depois seque-os por duas horas em um banco limpo. Certifique-se de que o calli não seja aderido ao papel do filtro e transfira-os para o meio de seleção primária NBD2.
Depois de duas semanas, transfira o calli uniformemente para uma nova placa contendo meio de seleção fresco, em seguida, mova o cali para o meio ms fresco para diferenciação e os brotos de tiro para ms médio com 10 miligramas por litro Hygromiccin para proliferar mais brotos. Transfira os novos brotos para meio MS para indução de raiz e culta-os sob luz a 25 a 28 graus Celsius. As plantas transformadas devem produzir raízes dentro de duas semanas.
Para realizar a observação do fenótipo reprodutivo, remova a palea e a lemma do florido e imagem de todos os anteros sob um microscópio estéreo. Para observar a viabilidade do pólen, escolha espinhos de arroz maduros antes da anestesia da flor e remova a palea e a lemma para liberar os antenos. Pegue seis anteras e coloque-os em um escorregador de vidro.
Adicione uma gota de água destilada, esmague o antero com pinças para liberar os grãos de pólen, em seguida, adicione duas a três gotas de solução de iodo e cubra com uma tampa. Observe o slide sob um microscópio de baixa ampliação. Grãos de pólen tingidos preto mostram viabilidade mais vigorosa, enquanto grãos sem cor ou aqueles marrom amarelo tingido são atrofiados ou degenerados.
Para realizar a microscopia transversal de secção, use uma solução azul de toluidina de 0,5% para colorar os slides por 30 minutos e enxágüe-os com água e seque-os na capa de fumaça. Uma vez seco, sele os slides com cola de árvore neutra, coloque delicadamente uma mancha de cobertura no slide e seque-os no capô da fumaça, em seguida, imagem a amostra sob um microscópio. Este protocolo foi usado para criar uma linha masculina estéril pela transformação genética mediada pela Agrobacterium no arroz.
Os cali embrionários foram utilizados diretamente para a transformação ou subcultos para proliferação para obter mais cali para infecção posterior. Após co-cultivar por 48 horas, os calli foram transferidos para uma segunda rodada de seleção. Após 10 a 14 dias, calli transformado mostrou microcalli recém-formado enquanto o calli não formado ficou marrom e morreu.
Posteriormente, cali de cor saudável e cremosa foram transferidos para o meio de regeneração. Os calli transformados mostraram gradualmente manchas verdes. Esses pontos verdes foram cultivados em meio de regeneração para permitir o crescimento de brotos e, em seguida, mudaram para meio MS médio para induzir raízes.
Mais tarde, foram colhidas brotos saudáveis e vigorosos de cultivo com raízes bem desenvolvidas. No total, foram obtidas 21 mudas regeneradas. Amplificação do PCR para a região da Higromicina mostrou que a frequência de transformação foi de aproximadamente 85,71% Os transformadores foram genótipos para identificar as mutações nos locais alvo do sgRNA.
Entre as 18 plantas transgênicas, oito linhas heterozigous e três linhas homozigos foram CRISPR CAS9 positivas. Os mutantes homozigos foram validados pela observação básica de órgãos reprodutivos masculinos. Os anthers de osabcg15 eram menores e mais pálidos do que os do tipo selvagem e não tinham grãos maduros de pólen.
A microscopia transversal foi realizada para investigar os defeitos morfológicos anteros em osabcg15. No estágio 10, microsporos do tipo selvagem tornaram-se em forma redonda e vacuolados com exina manchada azul escuro. Em contraste, os microsporos osabcg15 entraram em colapso e degradaram.
Ao tentar esse protocolo, é importante garantir que o material coletado esteja em fase de meiose e controlar o tempo seco do caldo.
