إن النسيلات الصغيرة ككزروع لإنتاج الهال مهمة لإنشاء تحول جيني سريع وفعال وطريقة تجديد للكشف عن وظيفة الجينات وكذلك لتحسين المحاصيل. إن الانحلال الصغير ككزروع لإنتاج الالة مهم لإنشاء تحول جيني سريع وفعال وطريقة تجديد للكشف عن وظيفة الجينات. عرض الفيديو من هذه التقنية سوف تساعد المشاهد على فهم عملية الحفاظ على المواد لإنتاج أن المواءمة التي تريد تحويلها وراثيا دون إضاعة الوقت والجهد.
تبدأ بجمع الأرز الصغير infloresences من حقل الأرز أو الدفيئة في مرحلة meiosis، والتأكد من أنها مغطاة مع غدد ورقة. امسح كل إنفليل مع مسحة كحولية بنسبة 70٪ واتركها تجف قبل القطع. جلب فيلنسي إلى مقعد مختبر معقمة وقطعها إلى قطع صغيرة مع مقص معقمة، ثم نقل القطع إلى لوحة بيتري التي تحتوي على وسيط NBD2.
احتضان لوحة في الظلام في 26 درجة مئوية لمدة 10 إلى 14 يوما للحث على كالوس. لإجراء التحول، نقل مستعمرة واحدة من لوحة EB بيضاء مع المضادات الحيوية الانتقائية إلى خمسة ملليلتر من وسيط YEB السائل الذي يحتوي على نفس المضادات الحيوية في أنبوب اختبار مخروطي 50 ملليلتر. هز الأنبوب على شاكر مداري في 250 مرة ز و 25 إلى 28 درجة مئوية حتى تنمو البكتيريا إلى OD 600 من 0.5.
إضافة ملليلتر واحد من التعليق البكتيري إلى 100 ملليلتر من المتوسط YEB مع نفس المضادات الحيوية الانتقائية في قارورة مخروطية 250 ملليلتر وهز القارورة على شاكر المداري في 250 مرة ز و 28 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. الطرد المركزي في الثقافة في 4، 000 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع البكتيريا. تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه مع AAM كما المتوسطة، ثم تمييع التعليق إلى OD 600 من 0.4.
بعد الحضانة، وجمع حوالي 150 صحي ضوء البذينة الصفراء كالي في قارورة معقم 150 ملليلتر. إضافة 50 إلى 75 ملليلتر من تعليق الخلية البكتيرية في قارورة ثم إضافة 10 إلى 25 ملليلتر من AAM الطازجة المتوسطة كما لغمر كالي لمدة 10 إلى 20 دقيقة، تهتز أحيانا. صب التعليق البكتيري من القارورة بعناية وتجفيف calli مع ورقة فلتر معقمة، ثم وضعها على طبق بيتري مع NBD AS المتوسطة وتغطيتها مع ورقة التصفية.
احتضان الكاودي في 25 إلى 28 درجة مئوية في الظلام لمدة ثلاثة أيام، والتحقق منها لإفراط في النمو البكتيري. بعد ثلاثة أيام من الزراعة المشتركة، نقل كالي إلى طبق بيتري العقيمة باستخدام ورقة التصفية، ثم الهواء الجافة لهم لمدة ساعتين على مقعد نظيفة. تأكد من عدم الالتزام بالـ calli لورقة التصفية ونقلها إلى وسيط الاختيار الأساسي NBD2.
بعد أسبوعين, نقل كالي بالتساوي إلى لوحة جديدة تحتوي على وسيلة اختيار جديدة, ثم نقل كالي إلى المتوسطة MS الطازجة للتمايز وبراعم تبادل لاطلاق النار إلى المتوسط MS مع 10 ملليغرام للتر هيغروميسين لتكاثر أكثر يطلق النار. نقل يطلق النار الجديد إلى نصف المتوسط MS لاستقراء الجذر وثقافتها تحت الضوء في 25 إلى 28 درجة مئوية. وينبغي أن تنتج النباتات المحولة جذور في غضون أسبوعين.
لأداء الملاحظة الظاهرية الإنجابية، وإزالة باليا وlemma من الزهور وصورة جميع النوبات تحت مجهر ستيريو. لمراقبة جدوى حبوب اللقاح، واختيار spikelets الأرز ناضجة قبل أنثيس زهرة وإزالة الباليه وlemma لإطلاق سراح الذرات. خذ ستة ذرات ووضعها على شريحة زجاجية.
إضافة قطرة واحدة من الماء المقطر، سحق أنثر مع ملاقط لإطلاق حبوب اللقاح، ثم إضافة 2-3 قطرات من محلول اليود وتغطية مع غطاء. مراقبة الشريحة تحت مجهر التكبير منخفضة. حبوب اللقاح السوداء الملوّهة تظهر قدرة أكثر قوة على البقاء في حين أن الحبوب التي لا لون لها أو تلك البني الأصفر المصبغة هي التقزم أو المنحطة.
لأداء المجهر المقطع عرضية، واستخدام 0.5٪ toluidine حل الأزرق لطخة الشرائح لمدة 30 دقيقة، ثم شطف لهم بالماء وتجفيفها في غطاء الدخان. مرة واحدة الجافة، وختم الشرائح مع الغراء شجرة محايدة، ووضع بلطف غطاء على الشريحة وتجفيفها في غطاء محرك الدخان، ثم صورة العينة تحت المجهر. وقد استخدم هذا البروتوكول لإنشاء خط عقيم الذكور من قبل التحول الجيني بوساطة Agrobacterium في الأرز.
استعملت ال "كاليّ" جنينيّة كان مباشرة للتحويل أو تربية فرعيّة للانتشار أن ينال أكثر كالّي ل عدوى بعيد. بعد الزراعة المشتركة لمدة 48 ساعة، تم نقل كالي إلى جولة ثانية من وسيط الاختيار. بعد 10 إلى 14 يوما، أظهرت كالي تحويلها microcalli شكلت حديثا في حين أن كالي غير مُنَتَهَم تحول إلى اللون البني ومات.
في وقت لاحق، تم نقل كالي الملونة صحية ودسمة في وسط التجديد. وأظهرت كالي تحول تدريجيا البقع الخضراء. وقد تم استزراع هذه البقع الخضراء في وسط التجديد للسماح بنمو إطلاق النار ثم تحولت إلى نصف متوسطة MS للحث على الجذور.
في وقت لاحق، تم حصاد براعم النمو صحية وقوية مع جذور متطورة. وفي المجموع، تم الحصول على 21 شتلة مجددة. بيّن تضخيم PCR لمنطقة هيغروميسين أن تردد التحول كان حوالي 85.71٪ تم تحديد الجينومية للتحويلات لتحديد الطفرات في المواقع المستهدفة من sgRNA.
من بين 18 النباتات المعدلة وراثيا، ثمانية خطوط heterozygous وثلاثة خطوط homozygous كانت CRISPR CAS9 إيجابية. تم التحقق من صحة المسوخ المهزوخ بالضربة القاضية من قبل ملاحظة الجهاز التناسلي الذكور الأساسية. كانت اثيرات osabcg15 أصغر وأكثر شحوبا من تلك من النوع البرية وتفتقر إلى حبوب اللقاح الناضجة.
تم إجراء مجهري المقطع العرضية للتحقيق في العيوب المورفولوجية في osabcg15. في المرحلة 10 ، أصبحت الجراثيم الدقيقة من النوع البري مستديرة الشكل ومشوشة مع exine الملون الأزرق الداكن. وعلى النقيض من ذلك، انهارت الجراثيم المجهرية osabcg15 وتدهورت.
عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم التأكد من أن المواد التي تم جمعها في مرحلة الداء الوسيم والتحكم في وقت جفاف الهواء من كالي.
