Le giovani infiorescenze come espianto per la produzione di callo sono importanti per stabilire una trasformazione genica rapida ed efficiente e un metodo di rigenerazione per rivelare la funzione genica e per il miglioramento delle colture. Le giovani infiorescenze come espianto per la produzione di callo sono importanti per stabilire una trasformazione genica rapida ed efficiente e il metodo di rigenerazione per rivelare la funzione genica. La dimostrazione video di questa tecnica aiuterà lo spettatore a comprendere il processo di manutenzione dei materiali per produrre quell'allineamento transgenico desiderato senza perdere tempo e fatica.
Inizia raccogliendo giovani infiorescenze di riso dalla risaia o da una serra in fase di meiosi, assicurandoti che siano coperte con la trafia fogliare. Pulire ogni infiorescenza con un tampone alcolico al 70% e lasciarla asciugare prima del taglio. Portare l'infiorescenza su un banco da laboratorio sterile e tagliarla a piccoli pezzi con forbici sterilizzate, quindi trasferire le talee su una piastra di Petri contenente mezzo NBD2.
Incubare la piastra al buio a 26 gradi Celsius per 10-14 giorni per indurre il callo. Per eseguire la trasformazione, trasferire una singola colonia dalla piastra EB bianca con antibiotici selettivi a cinque millilitri di mezzo YEB liquido contenente gli stessi antibiotici in una provetta sterile conica da 50 millilitri. Agitare il tubo su uno shaker orbitale a 250 volte g e da 25 a 28 gradi Celsius fino a quando i batteri non crescono fino a un OD 600 di 0,5.
Aggiungere un millilitro di sospensione batterica a 100 millilitri di mezzo YEB con gli stessi antibiotici selettivi in un pallone conico da 250 millilitri e scuotere il pallone su uno shaker orbitale a 250 volte g e 28 gradi Celsius per quattro ore. Centrifugare la coltura a 4.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con mezzo AAM AS, quindi diluire la sospensione in un OD 600 di 0,4.
Dopo l'incubazione, raccogliere circa 150 calli embriogeni giallo chiaro sani in un pallone sterile da 150 millilitri. Aggiungere da 50 a 75 millilitri della sospensione cellulare batterica nel pallone e quindi aggiungere da 10 a 25 millilitri di mezzo AAM AS fresco per immergere il calli per 10-20 minuti, tremando di tanto in tanto. Versare la sospensione batterica fuori dal pallone con cura e asciugare il calli con carta da filtro sterile, quindi posizionarli su una piastra di Petri con mezzo NBD AS e coprirli con carta da filtro.
Incubare il calli a 25-28 gradi Celsius al buio per tre giorni, controllandoli per la crescita troppo batterica. Dopo tre giorni di co-coltivazione, trasferire il calli in una piastra di Petri sterile utilizzando carta da filtro, quindi asciugarli ad aria per due ore su una panca pulita. Assicurarsi che il calli non sia rispettato alla carta filtrante e trasferirli al mezzo di selezione primario NBD2.
Dopo due settimane, trasferire il calli uniformemente su una nuova piastra contenente un nuovo mezzo di selezione, quindi spostare il calli su un mezzo MS fresco per la differenziazione e le gemme di germogli su mezzo MS con 10 milligrammi per litro di igromicina per proliferare più germogli. Trasferire i nuovi germogli in mezzo mezzo mezzo MS per l'induzione delle radici e culturarli sotto la luce a 25-28 gradi Celsius. Le piante trasformate dovrebbero produrre radici entro due settimane.
Per eseguire l'osservazione del fenotipo riproduttivo, rimuovere il palea e il lemma dal florido e ridire l'intero anthers al microscopio stereo. Per osservare la vitalità del polline, raccogliere le spighe di riso mature prima dell'antesi del fiore e rimuovere il palea e il lemma per rilasciare le anthers. Prendi sei anthers e mettili su uno scivolo di vetro.
Aggiungere una goccia di acqua distillata, schiacciare l'anther con una pinzetta per rilasciare i grani di polline, quindi aggiungere da due a tre gocce di soluzione di iodio e coprire con un coverslip. Osservare la diapositiva al microscopio a basso ingrandimento. I grani di polline tinti di nero mostrano una vitalità più vigorosa mentre i grani senza colore o quelli tinti di giallo marrone sono stentata o degenerati.
Per eseguire la microscopia di sezionamento trasversale, utilizzare la soluzione blu toluidina allo 0,5% per macchiare i vetrini per 30 minuti, quindi sciacquarli con acqua e asciugarli nella cappa dei fumi. Una volta asciutti, sigillare i vetrini con colla neutra dell'albero, posizionare delicatamente un coverslip sullo scivolo e asciugarli nel cappuccio dei fumi, quindi premere il campione al microscopio. Questo protocollo è stato utilizzato per creare una linea sterile maschile dalla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium nel riso.
I calli embriogenici sono stati utilizzati direttamente per la trasformazione o sottocolturati per la proliferazione per ottenere più calli per ulteriori infezioni. Dopo aver co-coltivato per 48 ore, i calli sono stati spostati su un secondo turno di mezzo di selezione. Dopo 10-14 giorni, calli trasformato mostrò microcalli appena formati mentre i calli non trasformati divennero marroni e morirono.
Successivamente, i calli colorati sani e cremosi sono stati trasferiti in mezzo di rigenerazione. Il calli trasformato ha gradualmente mostrato macchie verdi. Queste macchie verdi sono state coltivate in mezzo di rigenerazione per consentire la crescita del germoglio e poi spostate in mezzo mezzo mezzo SM per indurre radici.
Successivamente, sono stati raccolti germogli in crescita sani e vigorosi con radici ben sviluppate. In totale sono state ottenute 21 piantine rigenerate. L'amplificazione PCR per la regione della igromicina ha mostrato che la frequenza di trasformazione era di circa l'85,71%I trasformatori sono stati genotipati per identificare le mutazioni nei siti bersaglio dello sgRNA.
Tra le 18 piante transgeniche, otto linee eterozigoti e tre linee omozigote erano CRISPR CAS9 positive. I mutanti knockout omozigoti sono stati convalidati dall'osservazione di base degli organi riproduttivi maschili. Gli anthers di osabcg15 erano più piccoli e più pallidi di quelli del tipo selvaggio e mancavano di grani di polline maturi.
La microscopia a sezione trasversale è stata eseguita per indagare i difetti morfologici dell'ante in osabcg15. Allo stadio 10, le microspore di tipo selvatico divennero di forma rotonda e vacuolate con esine macchiata di blu scuro. Al contrario, le microspore osabcg15 sono crollate e degradate.
Quando si tenta questo protocollo, è importante assicurarsi che il materiale raccolto sia in fase di meiosi e controllare il tempo di asciugatura dell'aria del calli.
