农业细菌-中生菌遗传转化、转基因生产及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用

年轻的花序作为卡卢斯生产的基因外显，对于建立快速有效的基因转化和再生方法揭示基因功能以及作物改良非常重要。年轻的花序作为卡卢斯生产的基因外显，对于建立快速有效的基因转化和揭示基因功能的再生方法至关重要。这种技术的视频演示将帮助观看者了解维护材料的过程，以产生所需的转基因对齐，而不会浪费时间和精力。

首先从稻田或温室中采集幼米花序，确保它们被叶套覆盖。用 70%酒精拭子擦拭每个花序，在切割前晾干。将花序带到无菌实验室的长凳上，用消毒剪刀将其切成小块，然后将切口转移到含有 NBD2 介质的培养板中。

在黑暗中26摄氏度的温度下孵育板10至14天，以诱导卡卢斯。要进行转化，在50毫升锥形无菌试管中，将一个带选择性抗生素的白色EB板转移到含有相同抗生素的5毫升液体YEB介质中。在轨道摇床上以250倍g和25至28摄氏度摇动管子，直到细菌长到0.5的OD 600。

在250毫升锥形烧瓶中加入100毫升的YEB介质中1毫升的细菌悬浮液，并在250倍g和28摄氏度的轨道摇床上摇动烧瓶，4小时。在室温下将培养在4000克的培养器离心10分钟，以收集细菌。丢弃上一杯，用 AAM AS 介质重新悬浮颗粒，然后将悬浮液稀释至 0.4 的 OD 600。

孵育后，将大约150个健康的浅黄色胚胎卡收集到150毫升的无菌烧瓶中。将50至75毫升的细菌细胞悬浮液加入烧瓶中，然后加入10至25毫升的新鲜AM AS介质，浸入10至20分钟，偶尔摇晃。小心地将细菌悬浮液从烧瓶中倒出，然后用无菌滤纸干燥卡利，然后将它们放在带 NBD AS 介质的培养皿上，然后用滤纸盖住它们。

在黑暗中在25至28摄氏度的温度下孵育卡利三天，检查它们是否细菌过度生长。经过三天的共同栽培，使用滤纸将卡利转移到无菌培养皿中，然后在干净的长凳上晾干两个小时。确保卡利未粘附在滤纸上，并将它们传输到主选择介质 NBD2。

两周后，均匀地将卡利转移到含有新鲜选择介质的新板中，然后将卡利移动到新鲜的MS介质进行分化，将芽移动到MS介质，每升10毫克的海格霉素可增殖。将新芽转移到半MS介质中进行根诱导，并在25至28摄氏度的光线下培养它们。转化的植物应在两周内产生根。

要进行生殖表型观察，请从花光中去除古色，并在立体显微镜下成像整个表型。为了观察花粉的可行性，在花前挑选成熟的稻穗，取出古色和白草，释放花粉。拿六个安特，把它们放在玻璃滑梯上。

加入一滴蒸馏水，用钳子碾碎，然后释放花粉颗粒，然后加入两到三滴碘溶液，用盖玻片盖住。在低放大显微镜下观察幻灯片。花粉粒染成黑色显示更旺盛的生存能力，而没有颜色的颗粒或那些染色的黄棕色的颗粒发育迟缓或退化。

要进行横向分切显微镜，请使用 0.5% 的二丁蓝色溶液将幻灯片染色 30 分钟，然后用水冲洗并在烟罩中干燥。干燥后，用中性树胶密封幻灯片，轻轻将盖玻片放在幻灯片上，将其干燥在烟罩中，然后在显微镜下对样品进行成像。该协议用于通过农业细菌培养的水稻遗传转化创建男性无菌线。

胚胎致病直接用于转化或亚培养增殖，以获得更多的卡皮进一步感染。经过48小时的共同培养，该卡利被转移到第二轮选择媒介。10到14天后，转换的卡利显示新形成的微卡利，而未转换的卡利变成棕色和死亡。

后来，健康和奶油色的卡利被转移到再生介质。改造后的卡利逐渐显示出绿点。这些绿点在再生培养中培养，允许拍摄生长，然后转移到半MS培养中诱导根。

后来，健康而充满活力的生长芽与发达的根收获。共获得21株再生幼苗。Hygromycin 区域的 PCR 扩增表明，转化频率约为 85.71% 转化剂被基因型，以识别 sgRNA 靶点处的突变。

在18种转基因植物中，有8种异质线和3条同源线为CRISPR CAS9阳性。通过基本男性生殖器官观察验证了同源敲除突变体。osabcg15的外型比野生植物更小、更苍白，缺乏成熟的花粉颗粒。

对osabcg15中的外向形态缺陷进行了横向剖面显微镜研究。在第10阶段，野生型微孢子变成圆形，并用深蓝色染色的外显子进行排泄。相比之下，osabcg15微孔折叠和降解。

在尝试此协议时，必须确保收集的材料处于 meiosis 阶段，并控制 calli 的风干时间。