Name: 4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Fondazione Rioja Salud (Fondos FEDER) e del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) spagnolo (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda è finanziata da una borsa di studio dell'AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Coltiva C. elegans su piastre di Petri
<ol><li>Preparare le piastre NGM e seminarle con E. coli OP50 come fonte di cibo (Figura 1). Coltivare e mantenere C. elegans come descritto17. Conservare i piatti seminati a 4 °C per un massimo di un mese.</li>
	<li>Regolare le piastre alla temperatura desiderata prima di aggiungere i vermi.<ol>
<li>Per trasferire i vermi, rimuovere un pezzo di agar da un vecchio piatto e posizionarlo su un piatto fresco.</li>
		<li>In alternativa, cattura singoli animali con un raccoglitore di vermi sterile (un pezzo da 1 pollice di filo di platino calibro 32 con una punta appiattita, montato sulla punta di una pipetta Pasteur) e posizionali sulla nuova piastra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltiva i vermi alla temperatura desiderata.<ol>
<li>Coltivare i vermi C. elegans a 20 °C, la temperatura standard. Tuttavia, per analizzare lo sviluppo di mutanti termosensibili, eseguire un'incubazione notturna, di solito a 25 °C. Regolare la durata e la temperatura di questa incubazione secondo necessità, a seconda del mutante specifico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparare la registrazione al microscopio 4D prima di montare gli embrioni (Figura 2)
<ol><li>Impostare il microscopio e i controlli della temperatura prima di preparare l'embrione. Gli embrioni di C. elegans si dividono molto rapidamente. Preparati a iniziare la registrazione immediatamente dopo aver montato gli embrioni.</li>
	<li>Regolare la temperatura di registrazione a 15 °C, 20 °C o 25 °C.<ol>
<li>Registrare regolarmente gli embrioni a 25 °C. Registrare i mutanti termosensibili alla temperatura restrittiva per mostrare i loro fenotipi. Registrare un controllo WT (se eseguito in una preparazione diversa) alla stessa temperatura dei mutanti. NOTA: gli embrioni WT si sviluppano più velocemente a 25 °C e più lentamente a 15 °C senza ulteriori differenze nella linea cellulare. Posizionare i microscopi in una stanza a temperatura controllata. Un ulteriore controllo mediante raffreddamento o riscaldamento della slitta è altamente desiderabile. Ciò può essere ottenuto facendo circolare l'acqua a una temperatura specifica attraverso un anello metallico attorno all'obiettivo del microscopio e al condensatore. L'obiettivo e la preparazione sono a diretto contatto attraverso l'olio ad immersione e il trasferimento di temperatura è efficiente. Questo sistema consente un controllo preciso della temperatura di registrazione e l'esecuzione di sbalzi di temperatura durante lo sviluppo dell'embrione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire i parametri di registrazione nel software di microscopia.<ol>
<li>Per una registrazione standard di C. elegans (senza scansioni fluorescenti), selezionare: z-stack di 30 piani focali, ad una distanza di 1 micron ciascuno. Intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni z-stack. 1500 z-stack (12,5 ore di record). NOTA: sia i programmi di controllo del microscopio commerciali che quelli open source possono essere utilizzati per definire questo flusso di lavoro per l'acquisizione di immagini. Ora il microscopio è pronto per la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparare e montare gli embrioni
<ol><li>Preparare un tampone di agar sottile e omogeneo come primo passo per ottenere una bella immagine (Figura 3).<ol>
<li>Preparare 50 ml di una soluzione di agar al 4,5% in acqua deionizzata. Riscaldare a ebollizione nel microonde e versare 0,5 – 1 ml in tubi di vetro da 3 ml.</li>
		<li>Sigillare accuratamente i tubi con pellicola di cera per evitare l'essiccazione. I tubi di agar sigillati possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di due mesi.</li>
		<li>Sul banco di laboratorio, avere un blocco di calore a 80 °C con: una provetta di vaselina pura (fusa), con all'interno un pennello fine. una provetta con acqua distillata contenente una pipetta Pasteur. NOTA: questo assicura che tutti i materiali richiesti saranno caldi e l'agar non si solidificherà nel processo di produzione del pad.</li>
		<li>Rimuovere il film di cera dalla parte superiore di uno dei tubi di agar e riscaldarlo con cura su un bruciatore di alcol per sciogliere l'agar. Prestare attenzione poiché l'agar caldo espulso dal tubo di vetro potrebbe causare ustioni.</li>
		<li>Una volta che l'agar è fuso, posizionare il tubo nel blocco di calore per mantenere l'agar in forma liquida.</li>
		<li>In alternativa, posizionare i tubi di agar nel blocco di calore 1 ora prima dell'esperimento per scioglierli senza utilizzare un bruciatore. L'agar fuso dovrebbe essere scartato dopo un giorno.</li>
		<li>Posizionare un vetrino per microscopio (Slide A) tra altri due su un pezzo di plastica.</li>
		<li>Prendi un'altra diapositiva (Slide B) e tienila con le dita in una mano.</li>
		<li>Con l'altra mano, posizionare una piccola goccia di agar fuso al centro della diapositiva A usando la pipetta calda Pasteur.</li>
		<li>Premere immediatamente la diapositiva B sulla goccia di agar per creare un cuscinetto molto sottile tra le diapositive A e B. Tenere queste diapositive inserite insieme fino al punto 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare gli embrioni.<ol>
<li>Raccogli 5-10 ermafroditi gravidi con il raccoglitore e mettili in un bicchiere da orologiaio pieno d'acqua.</li>
		<li>Usa un bisturi per aprire i nematodi ermafroditi ed estrarre le uova precoci (1-4 cellule) dall'utero, sotto lo stereomicroscopio.</li>
		<li>Prendere la diapositiva dal passaggio 3.1.10 e far scorrere delicatamente la diapositiva B per esporre il tampone di agar sulla diapositiva A.</li>
		<li>Metti un uovo precoce al centro del cuscinetto di agar pipettando con un tubo capillare.</li>
		<li>In alternativa, pipettare una goccia contenente una serie di embrioni sul tampone di agar e quindi cercare embrioni in fase iniziale. Esegui questo passaggio sotto lo stereomicroscopio.</li>
		<li>Se necessario, sposta l'uovo spingendolo con una ciglia incollata all'estremità di uno stuzzicadenti.</li>
		<li>Rimuovere l'acqua in eccesso con la pipetta capillare. NOTA: Una pipetta capillare può essere facilmente preparata riscaldando una pipetta Pasteur su un bruciatore ad alcool e tirandola da entrambe le estremità.</li>
		<li>Coprire con cura la preparazione con un coverslip. Per evitare bolle d'aria, posizionare un bordo del coperchio sul vetrino e far scorrere delicatamente un bisturi lungo il bordo adiacente per drappeggiare lentamente e obliquamente il coperchio sulla preparazione.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta per riempire 3/4 dello spazio che circonda il tampone di agar con acqua. Lasciare 1/4 dello spazio con aria.</li>
		<li>Sigillare il coperchio con vaselina per evitare l'essiccazione durante lunghi periodi di registrazione.</li>
		<li>Utilizzare il pennello sottile per estendere un sottile strato di vaselina fusa attorno al bordo del coperchio. NOTA: ora la preparazione è pronta per la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Regolare il DIC e avviare la registrazione al microscopio 4D
<ol><li>Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Focalizzare l'embrione utilizzando l'obiettivo a basso ingrandimento (5x o 10x).</li>
	<li>Passare all'obiettivo di immersione 100x.</li>
	<li>Regolare i componenti ottici del microscopio per ottenere un'immagine di Nomarski.<ol>
<li>Focalizzare il condensatore.</li>
		<li>Aprire completamente l'apertura del condensatore e chiudere il diaframma di campo (questo fornirà un'apertura numerica più elevata e, quindi, una maggiore risoluzione).</li>
		<li>Verificare che entrambi i polarizzatori al microscopio siano orientati per causare la massima estinzione della luce.</li>
		<li>Ruota il prisma di Wollaston per ottenere una bella immagine tridimensionale dell'embrione, illuminata su un lato. Ruota il prisma nella direzione opposta per ottenere l'effetto di avere l'embrione illuminato dall'altra parte. NOTA: questi passaggi possono essere eseguiti su un campione di prova prima della registrazione in modo che sia necessaria solo la messa a punto del campione analizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dell'immagine al microscopio.</li>
</ol>5. Analizzare il filmato 4D (Figura 4).
NOTA: una volta completata la registrazione, utilizzare il software di tracciamento del lignaggio cellulare per ricostruire e analizzare il lignaggio cellulare.
Il software di tracciamento del lignaggio cellulare è un potente strumento per eseguire analisi dettagliate dello sviluppo embrionale o della dinamica in colture cellulari o frammenti di tessuto. Il programma estrae e quantifica diversi set di dati sulla dinamica cellulare del campione che includono la generazione del lignaggio cellulare completo di ogni singola cellula registrata, comprese le divisioni cellulari, la lunghezza del ciclo cellulare, la migrazione o l'apoptosi e la sua cinetica. Inoltre, la differenziazione cellulare può essere segnata dai cambiamenti morfologici della cellula o dall'espressione di marcatori specifici. Fondamentalmente, lo schermo del software visualizza due finestre: nella finestra di sinistra, il filmato 4D può essere riprodotto avanti e indietro o su e giù ai livelli superiore o inferiore in modo che ogni cella possa essere seguita nel tempo e nello spazio durante la registrazione. Sulla vedova destra, viene generato il lignaggio cellulare. Facendo clic su un nucleo cellulare nel filmato 4D si genera un punto nella finestra di lignaggio che memorizza le informazioni del nome della cellula, del destino e delle coordinate spaziali. Il lignaggio cellulare di una cellula specifica viene generato riproducendo il filmato 4D in avanti e facendo clic periodicamente sul nucleo per contrassegnare la mitosi di quella specifica cellula nel tempo. La ripetizione di questo processo per ciascuna delle cellule registrate genera il lignaggio cellulare completo dell'embrione o del campione. Le informazioni memorizzate per le coordinate spaziali di ciascuna cellula vengono successivamente utilizzate per ricostruire modelli embrionali 3D e percorsi di migrazione cellulare.
<ol><li>Apri il software di tracciamento del lignaggio e crea un nuovo progetto andando al menu della barra superiore e selezionando: | file Nuovo progetto.</li>
	<li>Selezionare il modello di derivazione della cella in base alla temperatura di registrazione: DB08 per la registrazione a 25 °C, DB10 per la registrazione a 20 °C e DB12 per la registrazione a 15 °C.</li>
	<li>Impostare i parametri di registrazione nella finestra emergente: conteggio delle scansioni (di solito 1500), tempo tra le scansioni (30 secondi), conteggio dei livelli (30) e distanza tra i livelli (1 micron).</li>
	<li>Selezionare il file immagine e il formato.<ol>
<li>Selezionare la directory delle immagini in cui sono state salvate le immagini.</li>
		<li>Scegli se le immagini devono essere salvate come immagini singole (un'immagine per livello e tempo) o come z-stack multi-immagine.</li>
		<li>Determinare la denominazione dei file e il formato dell'immagine. Di routine, le singole immagini vengono salvate con i seguenti nomi: X0000L00C1 (per scansione 0, livello 0, canale 1) X0000L01C1 (per scansione 0, livello 1, canale 1) X0000L02C1 (per scansione 0, livello 2, canale 1) ... X0001L00C1 (per scansione 1, livello 0, canale 1) X0001L01C1 (per la scansione 1, livello 1, canale 1) ... X0300L04C1 (per scansione 300, livello 4, canale 1) ... NOTA: il salvataggio delle immagini in un formato compresso consente di risparmiare spazio sul disco rigido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire i canali di luce: 1 per l'ottica DIC, 2 per GFP, 3 per RFP, ecc. Aggiungi quelli che sono stati utilizzati nella registrazione 4D. Fare clic su "elaborazione del canale abilitata" per rilevarli.</li>
	<li>Inizia a tracciare il lignaggio cellulare dell'embrione. Lo schermo ora contiene due finestre principali: la finestra video e la finestra di lignaggio cellulare.<ol>
<li>Nella finestra di lignaggio, selezionare un ramo di lignaggio e utilizzare il mouse per fare clic sul nucleo della cella corrispondente a questa cella nella finestra video.</li>
		<li>Segui la cella spazialmente e nel tempo riproducendo il filmato 4D in avanti, indietro o su o giù per un livello, usando i tasti cursore.</li>
		<li>Fare periodicamente clic sul nucleo cellulare. Questo genera un punto nel ramo del lignaggio e registra le coordinate spaziali della cellula in questo momento. Di conseguenza, il lignaggio cellulare progredisce e sono possibili ricostruzioni 3D dell'embrione.</li>
		<li>Contrassegnare la mitosi facendo clic sul tasto Invio. Quindi selezionare una delle celle figlie e seguirla come prima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere il processo (passaggi da 5.6.1 a 5.6.4) per il resto delle cellule embrionali per tracciare l'intero lignaggio cellulare o per seguire cellule specifiche di interesse come quelle sottoposte ad apoptosi.</li>
	<li>Confronta il lignaggio mutante con il lignaggio stereotipato delle cellule WT C. elegans .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una delle principali sfide della biologia moderna è la comprensione dello sviluppo di organismi multicellulari. C. elegans è emerso come uno dei modelli più adatti per studiare la sottile coordinazione tra proliferazione cellulare e differenziazione cellulare nell'embrione in via di sviluppo. Da un punto di vista ottico, il suo corpo trasparente e le sue piccole dimensioni rendono questo nematode un campione ideale per la microscopia DIC. Anche altri organismi con caratteristiche simili sono stati sottoposti all'analisi al microscopio 4D 11,12,13,14,15,16.
Per questi studi sullo sviluppo, l'inattivazione genica da parte della genetica in avanti o inversa fornisce un indizio sul suo coinvolgimento nell'embriogenesi. Una volta che un gene ha dimostrato di svolgere un ruolo nello sviluppo, il passo successivo è definire il suo ruolo esatto nella creazione del piano corporeo corretto. L'immunocolorazione è l'approccio selezionato per la maggior parte dei modelli. Questa tecnica chiarisce i problemi nella differenziazione cellulare o nell'espressione di marcatori specifici. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo approccio è che fornisce solo una visione statica dell'espressione di un singolo o più marcatori in un punto fisso dello sviluppo. Una visione dinamica di questi marcatori durante lo sviluppo può essere ottenuta solo colorando diversi embrioni in diversi punti temporali. Inoltre, la ricostruzione del lignaggio cellulare non è possibile in tali campioni fissi.
La microscopia 4D è un approccio complementare per lo studio dello sviluppo embrionale. Questa tecnica rivela le dinamiche di sviluppo a una risoluzione a livello cellulare. Qualsiasi difetto nell'embrione come problemi nell'orientamento del fuso, migrazione cellulare, apoptosi, specifica del destino cellulare, ecc. Apparirà in un film 4D che può essere visualizzato in avanti e indietro, quantificato e segnato dal ricercatore. Usando questa tecnica, praticamente ogni cellula dell'embrione può essere seguita fino al momento in cui l'embrione inizia a muoversi. Gli embrioni sottoposti a microscopia 4D con sola luce visibile e ottica Nomarski non subiscono fotodanni. Le scansioni fluorescenti possono anche essere intercalate all'interno della registrazione per rilevare quando e dove viene espresso un gene. Gli embrioni che subiscono un fotodanneggiamento significativo sono identificati dall'estensione del ciclo cellulare che causa una forte irradiazione UV rispetto a un embrione di lignaggio WT standard. In tal caso, il fotodanno può essere ridotto abbassando l'intensità della lampada UV e aumentando la sensibilità della fotocamera o il tempo di esposizione. Le caratteristiche morfologiche e i marcatori molecolari possono aiutare a chiarire lo sviluppo embrionale di qualsiasi mutante.
La creazione di un sistema di microscopia 4D è facile da implementare in laboratorio e, dopo un po 'di pratica, consente un'analisi senza pari della dinamica cellulare e del tracciamento del lignaggio di colture cellulari e campioni trasparenti viventi a un livello di risoluzione di ogni singola cellula nel campo del microscopio. Il tracciamento del lignaggio cellulare sulle immagini DIC viene ancora elaborato a mano. Richiede molto tempo e, sebbene il software rilevi errori di lignaggio come diversi rami di lignaggio che contrassegnano la stessa cella, sono possibili errori. Mentre il rilevamento automatico delle cellule marcate con GFP è ben sviluppato2, il software complementare di tracciamento del lignaggio basato su cellule non contrassegnate e immagini in luce visibile è ancora nella fase iniziale e non è realmente utile per un'analisi completa dell'embrione. Senza alcun dubbio, l'applicazione dei sistemi di riconoscimento delle immagini al campo della microscopia a luce visibile porterà un grande progresso in questo campo.

La microscopia 4D è un sistema di registrazione time-lapse multifocale che consente ai ricercatori di registrare e quantificare la dinamica cellulare di un campione biologico sia spazialmente che nel tempo. Colture cellulari, lieviti o tessuti viventi possono essere sottoposti ad analisi 4D ma questa tecnica è particolarmente adatta per analizzare lo sviluppo di embrioni viventi. La risoluzione di questa analisi raggiunge il livello di ogni singola cellula dell'embrione. Ogni divisione cellulare può essere rilevata e i movimenti cellulari possono essere tracciati nel tempo. I destini cellulari sono valutati in base alla posizione e alla forma che le cellule acquisiscono. L'uso dell'ottica Nomarski migliora il contrasto di campioni trasparenti non macchiati utilizzando fasci di luce polarizzati ortogonalmente che interferiscono sul piano focale. Le immagini risultanti appaiono tridimensionali, illuminate su un lato.
Altri metodi basati sull'uso della microscopia confocale e degli animali transgenici GFP per il rilevamento automatico dei nuclei e la generazione di lignaggi cellulari sono stati sviluppati 1,2. Il vantaggio di questi sistemi è ovvio: il software ignora di gran lunga la necessità di contrassegnare manualmente ogni nucleo per un periodo di tempo (anche se è necessaria una certa supervisione manuale durante le fasi finali). Tuttavia, i processi cellulari che coinvolgono cambiamenti nella forma cellulare o nella dinamica della membrana, come quelli che si verificano durante la differenziazione cellulare, la migrazione, l'apoptosi o l'inghiottimento di cadaveri, rimangono nascosti come sfondo nero nelle immagini dei nuclei marcati fluorescenti.
Al contrario, la microscopia 4D Nomarski (chiamata anche microscopia DIC, microscopia a contrasto a interferenza differenziale) mostra sia i nuclei che i cambiamenti di forma cellulare che si verificano durante lo sviluppo di animali selvatici o mutanti. Ciò consente il tracciamento del lignaggio cellulare utilizzando microscopi standard, impiegando solo luce trasmessa. Non vi è alcuna necessità generale di utilizzare animali transgenici se non per mostrare modelli di espressione specifici, nel qual caso le scansioni fluorescenti possono essere intercalate. Pertanto, questo potrebbe essere l'approccio ottimale per molti laboratori che lavorano su processi cellulari dinamici come l'embriogenesi o l'apoptosi che possono essere evidenziati sotto la microscopia DIC 3,4,5,6,7.
Sono disponibili diversi programmi flessibili e intuitivi per l'acquisizione di immagini microscopiche e la ricostruzione di lignaggi cellulari, modelli 3D, percorsi di migrazione cellulare, ecc. Nel campione registrato. In un esperimento standard, le immagini vengono acquisite in una serie di piani focali, a una distanza costante, il cui numero dipende dallo spessore del campione. La risoluzione temporale dell'analisi può essere ottimizzata aumentando la frequenza di scansione. Non c'è praticamente alcun limite per la durata della registrazione se non la capacità di archiviazione del computer. Ad esempio, per un'analisi dello sviluppo embrionale di C. elegans , acquisiamo regolarmente immagini su 30 piani focali (1 micron-passo ciascuno), ogni 30 secondi per 12 ore.
Questi sistemi sono stati applicati all'analisi di diversi embrioni animali come Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, altri embrioni di nematodi12,13, tardigradi14,15 e persino embrioni di topo precoci16. L'unico requisito è avere un embrione trasparente in grado di svilupparsi sulla preparazione del vetrino al microscopio.
In sintesi, la microscopia 4D basata su DIC è particolarmente utile per 1) analizzare lo sviluppo embrionale di piccoli animali trasparenti: tracciare il lignaggio cellulare, i percorsi di migrazione cellulare, la generazione di modelli 3D, ecc; 2) definizione dei modelli di espressione genica; 3) studiare le dinamiche di coltura cellulare, dal lievito alle cellule umane; 4) analizzare la dinamica dei tessuti o frammenti embrionali; 5) quantificare la cinetica della morte cellulare e l'inghiottimento del cadavere; e 6) eseguire analisi filogeniche comparative basate sulle caratteristiche dello sviluppo embrionale. Se c'è interesse per uno di questi argomenti (o simili), è possibile utilizzare la microscopia 4D.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Cell Lineage Tracing software</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Motorized microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td></tr><tr><td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td></tr></tbody></table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

La microscopia 4D è uno strumento inestimabile per svelare il processo di sviluppo embrionale in diversi animali. Negli ultimi decenni, Caenorhabditis elegans è emerso come uno dei migliori modelli per studiare lo sviluppo. Da un punto di vista ottico, le sue dimensioni e il corpo trasparente rendono questo nematode un campione ideale per la microscopia DIC (Differential Interference Contrast o Nomarski). Questo articolo illustra un protocollo per la coltivazione di nematodi C. elegans , la preparazione e il montaggio dei loro embrioni, l'esecuzione di microscopia 4D e tracciamento del lignaggio cellulare. Il metodo si basa su registrazioni time-lapse multifocali di immagini Nomarski e analisi con software specifici. Questa tecnica rivela le dinamiche di sviluppo embrionale a livello cellulare. Qualsiasi difetto embrionale nei mutanti, come problemi nell'orientamento del fuso, nella migrazione cellulare, nell'apoptosi o nella specifica del destino cellulare, può essere rilevato e valutato in modo efficiente. Praticamente ogni singola cellula dell'embrione può essere seguita fino al momento in cui l'embrione inizia a muoversi. Tracciare l'intero lignaggio cellulare di un embrione di C. elegans mediante microscopia DIC 4D è laborioso, ma l'uso di software specifici facilita notevolmente questo compito. Inoltre, questa tecnica è facile da implementare in laboratorio. La microscopia 4D è uno strumento versatile e apre la possibilità di eseguire un'analisi senza precedenti dello sviluppo embrionale.

Per caratterizzare lo sviluppo embrionale di un mutante C. elegans per il gene gsr-1, che codifica per l'enzima glutatione reduttasi, necessario per rigenerare il glutatione ridotto (GSH) e coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi redox nel nematode, abbiamo eseguito la microscopia 4D di un mutante di delezione gsr-1 (tm3574) che è un allele di perdita di funzione che causa un arresto embrionale precoce fenotipo18. Sia i nematodi WT che i nematodi C. elegans mutanti bilanciati gsr-1 (tm3574) sono stati coltivati su piastre NGM seminate con E. coli OP50 come fonte di cibo17. I vermi gsr-1 (tm3574) sono stati cresciuti come eterozigoti a 20 °C per due generazioni e poi i vermi omozigoti segreganti (che sono in grado di crescere fino all'età adulta grazie al carico materno) sono stati spostati a 25 °C per un'incubazione notturna prima dell'analisi embrionale. Le piastre a vite senza fine sono state incubate all'interno di scatole di cartone per evitare la condensa (Figura 1). I nematodi gravidi sono stati tagliati per estrarre giovani embrioni.
Per confrontare lo sviluppo embrionale del mutante rispetto al WT stereotipato in condizioni identiche, un embrione WT (come controllo) e un embrione gsr-1 (tm3574) sono stati posti sulla stessa preparazione uno accanto all'altro. Il flusso di lavoro della microscopia 4D è stato eseguito su un microscopio verticale motorizzato standard dotato di ottica DIC. I parametri di registrazione selezionati sul programma di controllo del microscopio erano: z-stack di 30 piani focali a 1 micron di distanza ciascuno, intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni z-stack e 1500 z-stacks (12,5 ore di registrazione). La temperatura di registrazione è stata regolata a 25 °C (sia nella stanza che sul palco del microscopio) (Figura 2).
Una volta completata la registrazione, il file di immagini è stato aperto e il lignaggio cellulare è stato ricostruito utilizzando un software di tracciamento del lignaggio facendo clic sui nuclei cellulari mostrati nella finestra video (Figura 4). Il lignaggio di cellule embrionali mutanti gsr-1 (tm3574) tracciato è stato confrontato con il lignaggio WT di C. elegans raffigurato sullo sfondo. Un risultato importante è stato il rilevamento di un progressivo ritardo del ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale. Di conseguenza, gli embrioni mutanti sono stati arrestati in fasi intermedie, mentre gli embrioni WT sono progrediti e infine si sono schiusi come larve.
La preparazione e l'osservazione diretta degli embrioni al microscopio o l'immunocolorazione con anticorpi contro marcatori embrionali tardivi potrebbe rivelare la presenza di un'alta percentuale di embrioni giovani nel mutante rispetto al WT. L'arresto embrionale potrebbe quindi essere dedotto come la spiegazione più plausibile. Tuttavia, la prova diretta e l'esatta quantificazione del ritardo del ciclo cellulare possono essere mostrate e quantificate in modo elegante e semplice solo attraverso un esperimento di microscopia 4D. Altre importanti caratteristiche dello sviluppo embrionale come la differenziazione cellulare o l'apoptosi (Figura 5) possono anche essere visualizzate in modo dinamico utilizzando la microscopia 4D che offre un'analisi dettagliata di molteplici aspetti dello sviluppo in un singolo esperimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figura 1: Nematodi di C. elegans che crescono in condizioni di laboratorio. I nematodi vengono coltivati su lastre NGM con semi di E. coli, conservati in scatole di cartone e incubati a 15 °C, 20 °C o 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figura 2: Screenshot del software di registrazione al microscopio 4D. Esempio di due diversi programmi software di controllo del microscopio (A e B). Questi programmi creano flussi di lavoro per controllare il microscopio e l'acquisizione di immagini durante la registrazione al microscopio 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figura 3: Fotografie seriali della preparazione del tampone di agar e del montaggio dell'embrione di C. elegans che mostra. A. Tubi di agar preparati. B-C. Preparazione del pad di agar. D. Scivolo parzialmente riempito d'acqua. E. Sigillare il vetrino con vaselina. F. Preparazione finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figura 4: Schermate seriali del software di tracciante del lignaggio cellulare. Il programma consente la ricostruzione del lignaggio cellulare embrionale di un mutante ritardante del ciclo cellulare (a sinistra) e di un embrione WT (a destra) di C. elegans . Un. Un primo passo dello sviluppo. B-C. Lo sviluppo di entrambi gli embrioni progredisce nel tempo. D. L'embrione WT si sviluppa correttamente e inizia l'allungamento mentre il mutante arresta. In tutti i casi il programma visualizza la finestra video e la finestra di lignaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figura 5: Forma refrattile di lenticchie di cellule apoptotiche in un embrione wt di C. elegans . Il destino cellulare, definito dalle caratteristiche morfologiche, può essere valutato al microscopio 4D. L'immagine mostra un embrione di C. elegans nella fase del fagiolo. Le cellule viventi mostrano nuclei di forma liscia circondati da un citoplasma granulare. Al contrario, le cellule apoptotiche (frecce gialle) condensano e adottano una forma refrattile simile a una lenticchia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.6K Views.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Singola lunghezza d&#39;onda Ombra Imaging di<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Stime Locomotion compresa Forza

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Ricerca

Ingegneria

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

Basato su Fourier analisi di diffrazione di Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Biologia dello sviluppo

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogenesi

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neuroscienze

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Singola lunghezza d'onda Ombra Imaging di

Basato su Fourier analisi di diffrazione di Live Caenorhabditis elegans

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All'inizio del Caenorhabditis elegans

Di base

L'uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in