Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Fondazione Rioja Salud (Fondos FEDER) e del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) spagnolo (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda è finanziata da una borsa di studio dell'AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Coltiva C. elegans su piastre di Petri
<ol><li>Preparare le piastre NGM e seminarle con E. coli OP50 come fonte di cibo (Figura 1). Coltivare e mantenere C. elegans come descritto17. Conservare i piatti seminati a 4 °C per un massimo di un mese.</li>
	<li>Regolare le piastre alla temperatura desiderata prima di aggiungere i vermi.<ol>
<li>Per trasferire i vermi, rimuovere un pezzo di agar da un vecchio piatto e posizionarlo su un piatto fresco.</li>
		<li>In alternativa, cattura singoli animali con un raccoglitore di vermi sterile (un pezzo da 1 pollice di filo di platino calibro 32 con una punta appiattita, montato sulla punta di una pipetta Pasteur) e posizionali sulla nuova piastra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltiva i vermi alla temperatura desiderata.<ol>
<li>Coltivare i vermi C. elegans a 20 °C, la temperatura standard. Tuttavia, per analizzare lo sviluppo di mutanti termosensibili, eseguire un'incubazione notturna, di solito a 25 °C. Regolare la durata e la temperatura di questa incubazione secondo necessità, a seconda del mutante specifico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparare la registrazione al microscopio 4D prima di montare gli embrioni (Figura 2)
<ol><li>Impostare il microscopio e i controlli della temperatura prima di preparare l'embrione. Gli embrioni di C. elegans si dividono molto rapidamente. Preparati a iniziare la registrazione immediatamente dopo aver montato gli embrioni.</li>
	<li>Regolare la temperatura di registrazione a 15 °C, 20 °C o 25 °C.<ol>
<li>Registrare regolarmente gli embrioni a 25 °C. Registrare i mutanti termosensibili alla temperatura restrittiva per mostrare i loro fenotipi. Registrare un controllo WT (se eseguito in una preparazione diversa) alla stessa temperatura dei mutanti. NOTA: gli embrioni WT si sviluppano più velocemente a 25 °C e più lentamente a 15 °C senza ulteriori differenze nella linea cellulare. Posizionare i microscopi in una stanza a temperatura controllata. Un ulteriore controllo mediante raffreddamento o riscaldamento della slitta è altamente desiderabile. Ciò può essere ottenuto facendo circolare l'acqua a una temperatura specifica attraverso un anello metallico attorno all'obiettivo del microscopio e al condensatore. L'obiettivo e la preparazione sono a diretto contatto attraverso l'olio ad immersione e il trasferimento di temperatura è efficiente. Questo sistema consente un controllo preciso della temperatura di registrazione e l'esecuzione di sbalzi di temperatura durante lo sviluppo dell'embrione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire i parametri di registrazione nel software di microscopia.<ol>
<li>Per una registrazione standard di C. elegans (senza scansioni fluorescenti), selezionare: z-stack di 30 piani focali, ad una distanza di 1 micron ciascuno. Intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni z-stack. 1500 z-stack (12,5 ore di record). NOTA: sia i programmi di controllo del microscopio commerciali che quelli open source possono essere utilizzati per definire questo flusso di lavoro per l'acquisizione di immagini. Ora il microscopio è pronto per la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparare e montare gli embrioni
<ol><li>Preparare un tampone di agar sottile e omogeneo come primo passo per ottenere una bella immagine (Figura 3).<ol>
<li>Preparare 50 ml di una soluzione di agar al 4,5% in acqua deionizzata. Riscaldare a ebollizione nel microonde e versare 0,5 – 1 ml in tubi di vetro da 3 ml.</li>
		<li>Sigillare accuratamente i tubi con pellicola di cera per evitare l'essiccazione. I tubi di agar sigillati possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di due mesi.</li>
		<li>Sul banco di laboratorio, avere un blocco di calore a 80 °C con: una provetta di vaselina pura (fusa), con all'interno un pennello fine. una provetta con acqua distillata contenente una pipetta Pasteur. NOTA: questo assicura che tutti i materiali richiesti saranno caldi e l'agar non si solidificherà nel processo di produzione del pad.</li>
		<li>Rimuovere il film di cera dalla parte superiore di uno dei tubi di agar e riscaldarlo con cura su un bruciatore di alcol per sciogliere l'agar. Prestare attenzione poiché l'agar caldo espulso dal tubo di vetro potrebbe causare ustioni.</li>
		<li>Una volta che l'agar è fuso, posizionare il tubo nel blocco di calore per mantenere l'agar in forma liquida.</li>
		<li>In alternativa, posizionare i tubi di agar nel blocco di calore 1 ora prima dell'esperimento per scioglierli senza utilizzare un bruciatore. L'agar fuso dovrebbe essere scartato dopo un giorno.</li>
		<li>Posizionare un vetrino per microscopio (Slide A) tra altri due su un pezzo di plastica.</li>
		<li>Prendi un'altra diapositiva (Slide B) e tienila con le dita in una mano.</li>
		<li>Con l'altra mano, posizionare una piccola goccia di agar fuso al centro della diapositiva A usando la pipetta calda Pasteur.</li>
		<li>Premere immediatamente la diapositiva B sulla goccia di agar per creare un cuscinetto molto sottile tra le diapositive A e B. Tenere queste diapositive inserite insieme fino al punto 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare gli embrioni.<ol>
<li>Raccogli 5-10 ermafroditi gravidi con il raccoglitore e mettili in un bicchiere da orologiaio pieno d'acqua.</li>
		<li>Usa un bisturi per aprire i nematodi ermafroditi ed estrarre le uova precoci (1-4 cellule) dall'utero, sotto lo stereomicroscopio.</li>
		<li>Prendere la diapositiva dal passaggio 3.1.10 e far scorrere delicatamente la diapositiva B per esporre il tampone di agar sulla diapositiva A.</li>
		<li>Metti un uovo precoce al centro del cuscinetto di agar pipettando con un tubo capillare.</li>
		<li>In alternativa, pipettare una goccia contenente una serie di embrioni sul tampone di agar e quindi cercare embrioni in fase iniziale. Esegui questo passaggio sotto lo stereomicroscopio.</li>
		<li>Se necessario, sposta l'uovo spingendolo con una ciglia incollata all'estremità di uno stuzzicadenti.</li>
		<li>Rimuovere l'acqua in eccesso con la pipetta capillare. NOTA: Una pipetta capillare può essere facilmente preparata riscaldando una pipetta Pasteur su un bruciatore ad alcool e tirandola da entrambe le estremità.</li>
		<li>Coprire con cura la preparazione con un coverslip. Per evitare bolle d'aria, posizionare un bordo del coperchio sul vetrino e far scorrere delicatamente un bisturi lungo il bordo adiacente per drappeggiare lentamente e obliquamente il coperchio sulla preparazione.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta per riempire 3/4 dello spazio che circonda il tampone di agar con acqua. Lasciare 1/4 dello spazio con aria.</li>
		<li>Sigillare il coperchio con vaselina per evitare l'essiccazione durante lunghi periodi di registrazione.</li>
		<li>Utilizzare il pennello sottile per estendere un sottile strato di vaselina fusa attorno al bordo del coperchio. NOTA: ora la preparazione è pronta per la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Regolare il DIC e avviare la registrazione al microscopio 4D
<ol><li>Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Focalizzare l'embrione utilizzando l'obiettivo a basso ingrandimento (5x o 10x).</li>
	<li>Passare all'obiettivo di immersione 100x.</li>
	<li>Regolare i componenti ottici del microscopio per ottenere un'immagine di Nomarski.<ol>
<li>Focalizzare il condensatore.</li>
		<li>Aprire completamente l'apertura del condensatore e chiudere il diaframma di campo (questo fornirà un'apertura numerica più elevata e, quindi, una maggiore risoluzione).</li>
		<li>Verificare che entrambi i polarizzatori al microscopio siano orientati per causare la massima estinzione della luce.</li>
		<li>Ruota il prisma di Wollaston per ottenere una bella immagine tridimensionale dell'embrione, illuminata su un lato. Ruota il prisma nella direzione opposta per ottenere l'effetto di avere l'embrione illuminato dall'altra parte. NOTA: questi passaggi possono essere eseguiti su un campione di prova prima della registrazione in modo che sia necessaria solo la messa a punto del campione analizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dell'immagine al microscopio.</li>
</ol>5. Analizzare il filmato 4D (Figura 4).
NOTA: una volta completata la registrazione, utilizzare il software di tracciamento del lignaggio cellulare per ricostruire e analizzare il lignaggio cellulare.
Il software di tracciamento del lignaggio cellulare è un potente strumento per eseguire analisi dettagliate dello sviluppo embrionale o della dinamica in colture cellulari o frammenti di tessuto. Il programma estrae e quantifica diversi set di dati sulla dinamica cellulare del campione che includono la generazione del lignaggio cellulare completo di ogni singola cellula registrata, comprese le divisioni cellulari, la lunghezza del ciclo cellulare, la migrazione o l'apoptosi e la sua cinetica. Inoltre, la differenziazione cellulare può essere segnata dai cambiamenti morfologici della cellula o dall'espressione di marcatori specifici. Fondamentalmente, lo schermo del software visualizza due finestre: nella finestra di sinistra, il filmato 4D può essere riprodotto avanti e indietro o su e giù ai livelli superiore o inferiore in modo che ogni cella possa essere seguita nel tempo e nello spazio durante la registrazione. Sulla vedova destra, viene generato il lignaggio cellulare. Facendo clic su un nucleo cellulare nel filmato 4D si genera un punto nella finestra di lignaggio che memorizza le informazioni del nome della cellula, del destino e delle coordinate spaziali. Il lignaggio cellulare di una cellula specifica viene generato riproducendo il filmato 4D in avanti e facendo clic periodicamente sul nucleo per contrassegnare la mitosi di quella specifica cellula nel tempo. La ripetizione di questo processo per ciascuna delle cellule registrate genera il lignaggio cellulare completo dell'embrione o del campione. Le informazioni memorizzate per le coordinate spaziali di ciascuna cellula vengono successivamente utilizzate per ricostruire modelli embrionali 3D e percorsi di migrazione cellulare.
<ol><li>Apri il software di tracciamento del lignaggio e crea un nuovo progetto andando al menu della barra superiore e selezionando: | file Nuovo progetto.</li>
	<li>Selezionare il modello di derivazione della cella in base alla temperatura di registrazione: DB08 per la registrazione a 25 °C, DB10 per la registrazione a 20 °C e DB12 per la registrazione a 15 °C.</li>
	<li>Impostare i parametri di registrazione nella finestra emergente: conteggio delle scansioni (di solito 1500), tempo tra le scansioni (30 secondi), conteggio dei livelli (30) e distanza tra i livelli (1 micron).</li>
	<li>Selezionare il file immagine e il formato.<ol>
<li>Selezionare la directory delle immagini in cui sono state salvate le immagini.</li>
		<li>Scegli se le immagini devono essere salvate come immagini singole (un'immagine per livello e tempo) o come z-stack multi-immagine.</li>
		<li>Determinare la denominazione dei file e il formato dell'immagine. Di routine, le singole immagini vengono salvate con i seguenti nomi: X0000L00C1 (per scansione 0, livello 0, canale 1) X0000L01C1 (per scansione 0, livello 1, canale 1) X0000L02C1 (per scansione 0, livello 2, canale 1) ... X0001L00C1 (per scansione 1, livello 0, canale 1) X0001L01C1 (per la scansione 1, livello 1, canale 1) ... X0300L04C1 (per scansione 300, livello 4, canale 1) ... NOTA: il salvataggio delle immagini in un formato compresso consente di risparmiare spazio sul disco rigido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire i canali di luce: 1 per l'ottica DIC, 2 per GFP, 3 per RFP, ecc. Aggiungi quelli che sono stati utilizzati nella registrazione 4D. Fare clic su "elaborazione del canale abilitata" per rilevarli.</li>
	<li>Inizia a tracciare il lignaggio cellulare dell'embrione. Lo schermo ora contiene due finestre principali: la finestra video e la finestra di lignaggio cellulare.<ol>
<li>Nella finestra di lignaggio, selezionare un ramo di lignaggio e utilizzare il mouse per fare clic sul nucleo della cella corrispondente a questa cella nella finestra video.</li>
		<li>Segui la cella spazialmente e nel tempo riproducendo il filmato 4D in avanti, indietro o su o giù per un livello, usando i tasti cursore.</li>
		<li>Fare periodicamente clic sul nucleo cellulare. Questo genera un punto nel ramo del lignaggio e registra le coordinate spaziali della cellula in questo momento. Di conseguenza, il lignaggio cellulare progredisce e sono possibili ricostruzioni 3D dell'embrione.</li>
		<li>Contrassegnare la mitosi facendo clic sul tasto Invio. Quindi selezionare una delle celle figlie e seguirla come prima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere il processo (passaggi da 5.6.1 a 5.6.4) per il resto delle cellule embrionali per tracciare l'intero lignaggio cellulare o per seguire cellule specifiche di interesse come quelle sottoposte ad apoptosi.</li>
	<li>Confronta il lignaggio mutante con il lignaggio stereotipato delle cellule WT C. elegans .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. 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M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una delle principali sfide della biologia moderna è la comprensione dello sviluppo di organismi multicellulari. C. elegans è emerso come uno dei modelli più adatti per studiare la sottile coordinazione tra proliferazione cellulare e differenziazione cellulare nell'embrione in via di sviluppo. Da un punto di vista ottico, il suo corpo trasparente e le sue piccole dimensioni rendono questo nematode un campione ideale per la microscopia DIC. Anche altri organismi con caratteristiche simili sono stati sottoposti all'analisi al microscopio 4D 11,12,13,14,15,16.
Per questi studi sullo sviluppo, l'inattivazione genica da parte della genetica in avanti o inversa fornisce un indizio sul suo coinvolgimento nell'embriogenesi. Una volta che un gene ha dimostrato di svolgere un ruolo nello sviluppo, il passo successivo è definire il suo ruolo esatto nella creazione del piano corporeo corretto. L'immunocolorazione è l'approccio selezionato per la maggior parte dei modelli. Questa tecnica chiarisce i problemi nella differenziazione cellulare o nell'espressione di marcatori specifici. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo approccio è che fornisce solo una visione statica dell'espressione di un singolo o più marcatori in un punto fisso dello sviluppo. Una visione dinamica di questi marcatori durante lo sviluppo può essere ottenuta solo colorando diversi embrioni in diversi punti temporali. Inoltre, la ricostruzione del lignaggio cellulare non è possibile in tali campioni fissi.
La microscopia 4D è un approccio complementare per lo studio dello sviluppo embrionale. Questa tecnica rivela le dinamiche di sviluppo a una risoluzione a livello cellulare. Qualsiasi difetto nell'embrione come problemi nell'orientamento del fuso, migrazione cellulare, apoptosi, specifica del destino cellulare, ecc. Apparirà in un film 4D che può essere visualizzato in avanti e indietro, quantificato e segnato dal ricercatore. Usando questa tecnica, praticamente ogni cellula dell'embrione può essere seguita fino al momento in cui l'embrione inizia a muoversi. Gli embrioni sottoposti a microscopia 4D con sola luce visibile e ottica Nomarski non subiscono fotodanni. Le scansioni fluorescenti possono anche essere intercalate all'interno della registrazione per rilevare quando e dove viene espresso un gene. Gli embrioni che subiscono un fotodanneggiamento significativo sono identificati dall'estensione del ciclo cellulare che causa una forte irradiazione UV rispetto a un embrione di lignaggio WT standard. In tal caso, il fotodanno può essere ridotto abbassando l'intensità della lampada UV e aumentando la sensibilità della fotocamera o il tempo di esposizione. Le caratteristiche morfologiche e i marcatori molecolari possono aiutare a chiarire lo sviluppo embrionale di qualsiasi mutante.
La creazione di un sistema di microscopia 4D è facile da implementare in laboratorio e, dopo un po 'di pratica, consente un'analisi senza pari della dinamica cellulare e del tracciamento del lignaggio di colture cellulari e campioni trasparenti viventi a un livello di risoluzione di ogni singola cellula nel campo del microscopio. Il tracciamento del lignaggio cellulare sulle immagini DIC viene ancora elaborato a mano. Richiede molto tempo e, sebbene il software rilevi errori di lignaggio come diversi rami di lignaggio che contrassegnano la stessa cella, sono possibili errori. Mentre il rilevamento automatico delle cellule marcate con GFP è ben sviluppato2, il software complementare di tracciamento del lignaggio basato su cellule non contrassegnate e immagini in luce visibile è ancora nella fase iniziale e non è realmente utile per un'analisi completa dell'embrione. Senza alcun dubbio, l'applicazione dei sistemi di riconoscimento delle immagini al campo della microscopia a luce visibile porterà un grande progresso in questo campo.

La microscopia 4D è un sistema di registrazione time-lapse multifocale che consente ai ricercatori di registrare e quantificare la dinamica cellulare di un campione biologico sia spazialmente che nel tempo. Colture cellulari, lieviti o tessuti viventi possono essere sottoposti ad analisi 4D ma questa tecnica è particolarmente adatta per analizzare lo sviluppo di embrioni viventi. La risoluzione di questa analisi raggiunge il livello di ogni singola cellula dell'embrione. Ogni divisione cellulare può essere rilevata e i movimenti cellulari possono essere tracciati nel tempo. I destini cellulari sono valutati in base alla posizione e alla forma che le cellule acquisiscono. L'uso dell'ottica Nomarski migliora il contrasto di campioni trasparenti non macchiati utilizzando fasci di luce polarizzati ortogonalmente che interferiscono sul piano focale. Le immagini risultanti appaiono tridimensionali, illuminate su un lato.
Altri metodi basati sull'uso della microscopia confocale e degli animali transgenici GFP per il rilevamento automatico dei nuclei e la generazione di lignaggi cellulari sono stati sviluppati 1,2. Il vantaggio di questi sistemi è ovvio: il software ignora di gran lunga la necessità di contrassegnare manualmente ogni nucleo per un periodo di tempo (anche se è necessaria una certa supervisione manuale durante le fasi finali). Tuttavia, i processi cellulari che coinvolgono cambiamenti nella forma cellulare o nella dinamica della membrana, come quelli che si verificano durante la differenziazione cellulare, la migrazione, l'apoptosi o l'inghiottimento di cadaveri, rimangono nascosti come sfondo nero nelle immagini dei nuclei marcati fluorescenti.
Al contrario, la microscopia 4D Nomarski (chiamata anche microscopia DIC, microscopia a contrasto a interferenza differenziale) mostra sia i nuclei che i cambiamenti di forma cellulare che si verificano durante lo sviluppo di animali selvatici o mutanti. Ciò consente il tracciamento del lignaggio cellulare utilizzando microscopi standard, impiegando solo luce trasmessa. Non vi è alcuna necessità generale di utilizzare animali transgenici se non per mostrare modelli di espressione specifici, nel qual caso le scansioni fluorescenti possono essere intercalate. Pertanto, questo potrebbe essere l'approccio ottimale per molti laboratori che lavorano su processi cellulari dinamici come l'embriogenesi o l'apoptosi che possono essere evidenziati sotto la microscopia DIC 3,4,5,6,7.
Sono disponibili diversi programmi flessibili e intuitivi per l'acquisizione di immagini microscopiche e la ricostruzione di lignaggi cellulari, modelli 3D, percorsi di migrazione cellulare, ecc. Nel campione registrato. In un esperimento standard, le immagini vengono acquisite in una serie di piani focali, a una distanza costante, il cui numero dipende dallo spessore del campione. La risoluzione temporale dell'analisi può essere ottimizzata aumentando la frequenza di scansione. Non c'è praticamente alcun limite per la durata della registrazione se non la capacità di archiviazione del computer. Ad esempio, per un'analisi dello sviluppo embrionale di C. elegans , acquisiamo regolarmente immagini su 30 piani focali (1 micron-passo ciascuno), ogni 30 secondi per 12 ore.
Questi sistemi sono stati applicati all'analisi di diversi embrioni animali come Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, altri embrioni di nematodi12,13, tardigradi14,15 e persino embrioni di topo precoci16. L'unico requisito è avere un embrione trasparente in grado di svilupparsi sulla preparazione del vetrino al microscopio.
In sintesi, la microscopia 4D basata su DIC è particolarmente utile per 1) analizzare lo sviluppo embrionale di piccoli animali trasparenti: tracciare il lignaggio cellulare, i percorsi di migrazione cellulare, la generazione di modelli 3D, ecc; 2) definizione dei modelli di espressione genica; 3) studiare le dinamiche di coltura cellulare, dal lievito alle cellule umane; 4) analizzare la dinamica dei tessuti o frammenti embrionali; 5) quantificare la cinetica della morte cellulare e l'inghiottimento del cadavere; e 6) eseguire analisi filogeniche comparative basate sulle caratteristiche dello sviluppo embrionale. Se c'è interesse per uno di questi argomenti (o simili), è possibile utilizzare la microscopia 4D.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

La microscopia 4D è uno strumento inestimabile per svelare il processo di sviluppo embrionale in diversi animali. Negli ultimi decenni, Caenorhabditis elegans è emerso come uno dei migliori modelli per studiare lo sviluppo. Da un punto di vista ottico, le sue dimensioni e il corpo trasparente rendono questo nematode un campione ideale per la microscopia DIC (Differential Interference Contrast o Nomarski). Questo articolo illustra un protocollo per la coltivazione di nematodi C. elegans , la preparazione e il montaggio dei loro embrioni, l'esecuzione di microscopia 4D e tracciamento del lignaggio cellulare. Il metodo si basa su registrazioni time-lapse multifocali di immagini Nomarski e analisi con software specifici. Questa tecnica rivela le dinamiche di sviluppo embrionale a livello cellulare. Qualsiasi difetto embrionale nei mutanti, come problemi nell'orientamento del fuso, nella migrazione cellulare, nell'apoptosi o nella specifica del destino cellulare, può essere rilevato e valutato in modo efficiente. Praticamente ogni singola cellula dell'embrione può essere seguita fino al momento in cui l'embrione inizia a muoversi. Tracciare l'intero lignaggio cellulare di un embrione di C. elegans mediante microscopia DIC 4D è laborioso, ma l'uso di software specifici facilita notevolmente questo compito. Inoltre, questa tecnica è facile da implementare in laboratorio. La microscopia 4D è uno strumento versatile e apre la possibilità di eseguire un'analisi senza precedenti dello sviluppo embrionale.

Per caratterizzare lo sviluppo embrionale di un mutante C. elegans per il gene gsr-1, che codifica per l'enzima glutatione reduttasi, necessario per rigenerare il glutatione ridotto (GSH) e coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi redox nel nematode, abbiamo eseguito la microscopia 4D di un mutante di delezione gsr-1 (tm3574) che è un allele di perdita di funzione che causa un arresto embrionale precoce fenotipo18. Sia i nematodi WT che i nematodi C. elegans mutanti bilanciati gsr-1 (tm3574) sono stati coltivati su piastre NGM seminate con E. coli OP50 come fonte di cibo17. I vermi gsr-1 (tm3574) sono stati cresciuti come eterozigoti a 20 °C per due generazioni e poi i vermi omozigoti segreganti (che sono in grado di crescere fino all'età adulta grazie al carico materno) sono stati spostati a 25 °C per un'incubazione notturna prima dell'analisi embrionale. Le piastre a vite senza fine sono state incubate all'interno di scatole di cartone per evitare la condensa (Figura 1). I nematodi gravidi sono stati tagliati per estrarre giovani embrioni.
Per confrontare lo sviluppo embrionale del mutante rispetto al WT stereotipato in condizioni identiche, un embrione WT (come controllo) e un embrione gsr-1 (tm3574) sono stati posti sulla stessa preparazione uno accanto all'altro. Il flusso di lavoro della microscopia 4D è stato eseguito su un microscopio verticale motorizzato standard dotato di ottica DIC. I parametri di registrazione selezionati sul programma di controllo del microscopio erano: z-stack di 30 piani focali a 1 micron di distanza ciascuno, intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni z-stack e 1500 z-stacks (12,5 ore di registrazione). La temperatura di registrazione è stata regolata a 25 °C (sia nella stanza che sul palco del microscopio) (Figura 2).
Una volta completata la registrazione, il file di immagini è stato aperto e il lignaggio cellulare è stato ricostruito utilizzando un software di tracciamento del lignaggio facendo clic sui nuclei cellulari mostrati nella finestra video (Figura 4). Il lignaggio di cellule embrionali mutanti gsr-1 (tm3574) tracciato è stato confrontato con il lignaggio WT di C. elegans raffigurato sullo sfondo. Un risultato importante è stato il rilevamento di un progressivo ritardo del ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale. Di conseguenza, gli embrioni mutanti sono stati arrestati in fasi intermedie, mentre gli embrioni WT sono progrediti e infine si sono schiusi come larve.
La preparazione e l'osservazione diretta degli embrioni al microscopio o l'immunocolorazione con anticorpi contro marcatori embrionali tardivi potrebbe rivelare la presenza di un'alta percentuale di embrioni giovani nel mutante rispetto al WT. L'arresto embrionale potrebbe quindi essere dedotto come la spiegazione più plausibile. Tuttavia, la prova diretta e l'esatta quantificazione del ritardo del ciclo cellulare possono essere mostrate e quantificate in modo elegante e semplice solo attraverso un esperimento di microscopia 4D. Altre importanti caratteristiche dello sviluppo embrionale come la differenziazione cellulare o l'apoptosi (Figura 5) possono anche essere visualizzate in modo dinamico utilizzando la microscopia 4D che offre un'analisi dettagliata di molteplici aspetti dello sviluppo in un singolo esperimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figura 1: Nematodi di C. elegans che crescono in condizioni di laboratorio. I nematodi vengono coltivati su lastre NGM con semi di E. coli, conservati in scatole di cartone e incubati a 15 °C, 20 °C o 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figura 2: Screenshot del software di registrazione al microscopio 4D. Esempio di due diversi programmi software di controllo del microscopio (A e B). Questi programmi creano flussi di lavoro per controllare il microscopio e l'acquisizione di immagini durante la registrazione al microscopio 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figura 3: Fotografie seriali della preparazione del tampone di agar e del montaggio dell'embrione di C. elegans che mostra. A. Tubi di agar preparati. B-C. Preparazione del pad di agar. D. Scivolo parzialmente riempito d'acqua. E. Sigillare il vetrino con vaselina. F. Preparazione finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figura 4: Schermate seriali del software di tracciante del lignaggio cellulare. Il programma consente la ricostruzione del lignaggio cellulare embrionale di un mutante ritardante del ciclo cellulare (a sinistra) e di un embrione WT (a destra) di C. elegans . Un. Un primo passo dello sviluppo. B-C. Lo sviluppo di entrambi gli embrioni progredisce nel tempo. D. L'embrione WT si sviluppa correttamente e inizia l'allungamento mentre il mutante arresta. In tutti i casi il programma visualizza la finestra video e la finestra di lignaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figura 5: Forma refrattile di lenticchie di cellule apoptotiche in un embrione wt di C. elegans . Il destino cellulare, definito dalle caratteristiche morfologiche, può essere valutato al microscopio 4D. L'immagine mostra un embrione di C. elegans nella fase del fagiolo. Le cellule viventi mostrano nuclei di forma liscia circondati da un citoplasma granulare. Al contrario, le cellule apoptotiche (frecce gialle) condensano e adottano una forma refrattile simile a una lenticchia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K Views.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per l'individuazione di specifici obiettivi cellulari all'interno di grandi volumi

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...