Name: 4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينوه بالدعم المقدم من مؤسسة ريوخا سالود (Fondos FEDER) ووزارة العلوم الإسبانية ، Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). يتم تمويل كريستينا روميرو أراندا من خلال زمالة من AECC (الرابطة الإسبانية كونترا إل كانسر).

1. تنمو C. elegans على أطباق بتري
<ol><li>تحضير أطباق NGM وزرعها باستخدام E. coli OP50 كمصدر للغذاء (الشكل 1). تنمو وتحافظ على C. elegans كما هو موضح17. قم بتخزين الألواح المصنفة على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.</li>
	<li>اضبط الألواح على درجة الحرارة المطلوبة قبل إضافة الديدان.<ol>
<li>لنقل الديدان ، قم بإزالة قطعة من الآجار من طبق قديم وضعها على طبق طازج.</li>
		<li>بدلا من ذلك ، التقط مفردة باستخدام منتقي دودة معقمة (قطعة مقاس 1 بوصة من سلك بلاتيني بقياس 32 مع طرف مسطح ، مثبت على طرف ماصة باستور) وضعها على اللوحة الجديدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تنمو الديدان في درجة الحرارة المطلوبة.<ol>
<li>تنمو ديدان C. elegans عند 20 درجة مئوية ، درجة الحرارة القياسية. ومع ذلك ، لتحليل تطور الطفرات الحساسة للحرارة ، قم بإجراء حضانة بين عشية وضحاها ، عادة عند 25 درجة مئوية. اضبط مدة ودرجة حرارة هذه الحضانة حسب الحاجة ، اعتمادا على المتحور المحدد.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. إعداد تسجيل المجهر 4D قبل تركيب الأجنة (الشكل 2)
<ol><li>قم بإعداد المجهر وضوابط درجة الحرارة قبل تحضير الجنين. C. تنقسم أجنة elegans بسرعة كبيرة. كن مستعدا لبدء التسجيل مباشرة بعد تركيب الأجنة.</li>
	<li>اضبط درجة حرارة التسجيل إما على 15 درجة مئوية أو 20 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية.<ol>
<li>تسجيل الأجنة بشكل روتيني عند 25 درجة مئوية. سجل الطفرات الحساسة للحرارة عند درجة الحرارة المقيدة لإظهار أنماطها الظاهرية. سجل عنصر تحكم WT (إذا تم إجراؤه في إعداد مختلف) في نفس درجة حرارة الطفرات. ملاحظة: تتطور أجنة WT بشكل أسرع عند 25 درجة مئوية وأبطأ عند 15 درجة مئوية دون اختلافات إضافية في نسب الخلايا. ضع المجاهر في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها. التحكم الإضافي عن طريق تبريد أو تسخين الشريحة أمر مرغوب فيه للغاية. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تدوير الماء عند درجة حرارة محددة من خلال حلقة معدنية حول هدف المجهر والمكثف. الهدف والتحضير على اتصال مباشر من خلال زيت الغمر ونقل درجة الحرارة فعال. يسمح هذا النظام بالتحكم الدقيق في درجة حرارة التسجيل وإجراء تحولات درجة الحرارة أثناء تطور الجنين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد معلمات السجل في برنامج الفحص المجهري.<ol>
<li>للحصول على تسجيل C. elegans قياسي (بدون عمليات مسح الفلورسنت)، حدد: مكدسات z من 30 مستوى بؤري ، على مسافة 1 ميكرون لكل منها. 30 ثانية فترات بين بداية كل مكدس z. 1500 z-stacks (12.5 ساعة من السجل). ملاحظة: يمكن استخدام كل من برامج التحكم في المجهر التجارية والمفتوحة المصدر لتحديد سير العمل هذا لالتقاط الصور. الآن المجهر جاهز للتسجيل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. إعداد وتركيب الأجنة
<ol><li>قم بإعداد وسادة أجار رقيقة ومتجانسة كخطوة أولى في الحصول على صورة جميلة (الشكل 3).<ol>
<li>تحضير 50 مل من محلول أجار 4.5 ٪ في الماء منزوع الأيونات. يسخن حتى يغلي في الميكروويف ويصب 0.5 - 1 مل في أنابيب زجاجية سعة 3 مل.</li>
		<li>أغلق الأنابيب بعناية بفيلم شمعي لتجنب الجفاف. يمكن تخزين أنابيب أجار المختومة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهرين.</li>
		<li>على مقعد المختبر ، احصل على كتلة حرارة عند 80 درجة مئوية مع: أنبوب اختبار من هلام البترول النقي (مذاب) ، مع فرشاة طلاء دقيقة في الداخل. أنبوب اختبار مع الماء المقطر الذي يحتوي على ماصة باستور. ملاحظة: هذا يضمن أن جميع المواد المطلوبة ستكون ساخنة ، ولن تتصلب الأجار في عملية صنع اللوحة.</li>
		<li>قم بإزالة فيلم الشمع من أعلى أحد أنابيب الأجار ، وقم بتسخينه بعناية فوق موقد كحول لإذابة الأجار. توخ الحذر لأن الأجار الساخن الذي يتم طرده من الأنبوب الزجاجي يمكن أن يسبب حروقا.</li>
		<li>بمجرد ذوبان الآجار ، ضع الأنبوب في كتلة الحرارة للحفاظ على الآجار في شكل سائل.</li>
		<li>بدلا من ذلك ، ضع أنابيب الأجار في كتلة الحرارة 1h قبل التجربة لإذابتها دون استخدام الموقد. يجب التخلص من الآجار المذاب بعد يوم واحد.</li>
		<li>ضع شريحة مجهرية (شريحة A) بين اثنين آخرين على قطعة من البلاستيك.</li>
		<li>خذ شريحة أخرى (الشريحة B) وأمسكها بأصابعك بيد واحدة.</li>
		<li>من ناحية أخرى ، ضع قطرة صغيرة من الآجار المذاب في وسط الشريحة A باستخدام ماصة باستور الدافئة.</li>
		<li>اضغط على الشريحة B على الفور على قطرة الأجار لإنشاء لوحة رقيقة جدا بين الشريحتين A وB. احتفظ بهذه الشرائح محصورة معا حتى الخطوة 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جبل الأجنة.<ol>
<li>اجمع 5-10 خنثى محبب مع المنتقي وضعها في كوب صانع ساعات مملوء بالماء.</li>
		<li>استخدم مشرطا لقطع الديدان الخيطية الخنثى واستخراج البيض المبكر (1-4 خلايا) من الرحم ، تحت المجهر المجسم.</li>
		<li>خذ الشريحة من الخطوة 3.1.10 وقم بتحريك الشريحة B برفق لكشف لوحة الأجار على الشريحة A.</li>
		<li>ضع بيضة مبكرة في وسط وسادة الآجار عن طريق السحب باستخدام أنبوب شعري.</li>
		<li>بدلا من ذلك ، ماصة قطرة تحتوي على مجموعة من الأجنة على وسادة أجار ثم ابحث عن أجنة في مرحلة مبكرة. قم بهذه الخطوة تحت المجهر المجسم.</li>
		<li>إذا لزم الأمر ، حرك البيضة عن طريق دفعها برموش لاصق في نهاية المسواك.</li>
		<li>إزالة الماء الزائد مع ماصة الشعيرات الدموية. ملاحظة: يمكن بسهولة تحضير ماصة شعرية عن طريق تسخين ماصة باستور فوق موقد كحول وسحبها من كلا الطرفين.</li>
		<li>قم بتغطية التحضير بعناية باستخدام غطاء لاصق. لتجنب فقاعات الهواء، ضع حافة واحدة من الغطاء على الشريحة وحرك مشرطا برفق على طول الحافة المجاورة للف الغطاء ببطء وبشكل غير مباشر على المستحضر.</li>
		<li>استخدم ماصة لملء 3/4 من المساحة المحيطة بوسادة الأجار بالماء. اترك 1/4 من المساحة مع الهواء.</li>
		<li>أغلق الغطاء بالفازلين لتجنب الجفاف أثناء فترات التسجيل الطويلة.</li>
		<li>استخدم الفرشاة الدقيقة لتمديد طبقة رقيقة من الفازلين المذاب حول حافة الغطاء. ملاحظة: الآن الإعداد جاهز للتسجيل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ضبط DIC وبدء تسجيل المجهر 4D
<ol><li>ضع الشريحة على مرحلة المجهر. ركز الجنين باستخدام هدف التكبير المنخفض (5x أو 10x).</li>
	<li>التغيير إلى هدف الغمر 100x.</li>
	<li>اضبط المكونات البصرية للمجهر للحصول على صورة نومارسكي.<ol>
<li>ركز المكثف.</li>
		<li>افتح فتحة المكثف بالكامل وأغلق الحجاب الحاجز الميداني (سيوفر ذلك فتحة رقمية أعلى وبالتالي دقة أكبر).</li>
		<li>تحقق من أن كلا المستقطبين على المجهر موجهان للتسبب في أقصى قدر من انقراض الضوء.</li>
		<li>أدر منشور ولاستون للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد لطيفة للجنين ، مضاءة على جانب واحد. أدر المنشور في الاتجاه الآخر للحصول على تأثير إضاءة الجنين على الجانب الآخر. ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوات على عينة اختبار قبل التسجيل بحيث لا يلزم سوى الضبط الدقيق على العينة التي يتم تحليلها.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بتشغيل التقاط الصورة في المجهر.</li>
</ol>5. تحليل الفيلم 4D (الشكل 4).
ملاحظة: بمجرد اكتمال التسجيل، استخدم برنامج تتبع نسب الخلايا لإعادة بناء وتحليل نسب الخلية.
يعد برنامج تتبع نسب الخلايا أداة قوية لإجراء تحليلات مفصلة للتطور الجنيني أو الديناميكيات في مزارع الخلايا أو شظايا الأنسجة. يقوم البرنامج باستخراج وقياس العديد من مجموعات البيانات حول الديناميكيات الخلوية للعينة والتي تشمل توليد السلالة الخلوية الكاملة لكل خلية مسجلة، بما في ذلك انقسامات الخلايا وطول دورة الخلية والهجرة أو موت الخلايا المبرمج بالإضافة إلى حركياتها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تسجيل تمايز الخلايا من خلال التغيرات المورفولوجية للخلية أو عن طريق التعبير عن علامات محددة. في الأساس ، تعرض شاشة البرنامج نافذتين: في النافذة اليسرى ، يمكن تشغيل فيلم 4D إلى الأمام والخلف أو لأعلى ولأسفل إلى المستويات العليا أو السفلية بحيث يمكن متابعة كل خلية في الوقت والمكان طوال التسجيل. على الأرملة اليمنى ، يتم إنشاء سلالة الخلية. يؤدي النقر فوق نواة خلية في فيلم 4D إلى إنشاء نقطة في نافذة النسب التي تخزن معلومات اسم الخلية ومصيرها وإحداثياتها المكانية. يتم إنشاء سلالة الخلية لخلية معينة عن طريق تشغيل فيلم 4D إلى الأمام والنقر بشكل دوري على النواة لوضع علامة على الانقسام الخيطي لتلك الخلية المحددة بمرور الوقت. تكرار هذه العملية لكل خلية من الخلايا المسجلة يولد السلالة الخلوية الكاملة للجنين أو العينة. يتم استخدام المعلومات المخزنة للإحداثيات المكانية لكل خلية في وقت لاحق لإعادة بناء نماذج الأجنة 3D ومسارات هجرة الخلايا.
<ol><li>افتح برنامج تتبع النسب وأنشئ مشروعا جديدا بالانتقال إلى قائمة الشريط العلوي وتحديد: | الملفات مشروع جديد.</li>
	<li>حدد قالب نسب الخلية اعتمادا على درجة حرارة التسجيل: DB08 للتسجيل عند 25 درجة مئوية، DB10 للتسجيل عند 20 درجة مئوية، وDB12 للتسجيل عند 15 درجة مئوية.</li>
	<li>اضبط معلمات التسجيل في النافذة الناشئة: عدد المسح الضوئي (عادة 1500) ، والوقت بين عمليات المسح الضوئي (30 ثانية) ، وعدد المستويات (30) والمسافة بين المستويات (1 ميكرون).</li>
	<li>حدد ملف الصورة وتنسيقها.<ol>
<li>حدد دليل الصور حيث تم حفظ الصور.</li>
		<li>اختر ما إذا كان يجب حفظ الصور كصور مفردة (صورة واحدة لكل مستوى ووقت) أو كمكدسات z متعددة الصور.</li>
		<li>تحديد تسمية الملف وتنسيق الصورة. بشكل روتيني ، يتم حفظ الصور الفردية تحت الأسماء التالية: X0000L00C1 (للمسح الضوئي 0، المستوى 0، القناة 1) X0000L01C1 (للمسح الضوئي 0، المستوى 1، القناة 1) X0000L02C1 (للمسح الضوئي 0، المستوى 2، القناة 1) ... X0001L00C1 (للمسح الضوئي 1، المستوى 0، القناة 1) X0001L01C1 (للمسح الضوئي 1، المستوى 1، القناة 1) ... X0300L04C1 (للمسح الضوئي 300، المستوى 4، القناة 1) ... ملاحظة: يؤدي حفظ الصور بتنسيق مضغوط إلى توفير مساحة على القرص الثابت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حدد قنوات الضوء: 1 لبصريات DIC ، 2 ل GFP ، 3 ل RFP ، إلخ. أضف تلك التي تم استخدامها في تسجيل 4D. انقر فوق "تمكين معالجة القناة" لاكتشافها.</li>
	<li>ابدأ في تتبع سلالة خلية الجنين. تحتوي الشاشة الآن على نافذتين رئيسيتين: نافذة الفيديو ونافذة نسب الخلية.<ol>
<li>في نافذة النسب، حدد فرع النسب واستخدم الماوس للنقر فوق نواة الخلية المقابلة لهذه الخلية في نافذة الفيديو.</li>
		<li>اتبع الخلية مكانيا ومع مرور الوقت عن طريق تشغيل فيلم 4D إلى الأمام أو الخلف أو لأعلى أو لأسفل مستوى ، باستخدام مفاتيح المؤشر.</li>
		<li>انقر بشكل دوري على نواة الخلية. هذا يولد نقطة في فرع النسب ويسجل الإحداثيات المكانية للخلية في هذا الوقت. نتيجة لذلك ، يتقدم نسب الخلية ، ومن الممكن إعادة بناء الجنين 3D.</li>
		<li>ضع علامة على الانقسام بالنقر فوق مفتاح الرجوع. ثم حدد إحدى الخلايا الابنة واتبعها كما كان من قبل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>كرر العملية (الخطوات من 5.6.1 إلى 5.6.4) لبقية الخلايا الجنينية لتتبع سلالة الخلايا الكاملة ، أو لمتابعة خلايا محددة ذات أهمية مثل تلك التي تمر بموت الخلايا المبرمج.</li>
	<li>قارن السلالة المتحولة مع سلالة خلية WT C. elegans النمطية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

أحد التحديات الرئيسية في علم الأحياء الحديث هو فهم تطور الكائنات الحية متعددة الخلايا. برزت C. elegans كواحدة من أفضل النماذج المناسبة لدراسة التنسيق الدقيق بين تكاثر الخلايا وتمايز الخلايا في الجنين النامي. من وجهة نظر بصرية ، فإن جسمها الشفاف وحجمها الصغير يجعلان هذه الديدان الخيطية عينة مثالية للفحص المجهري DIC. كما خضعت كائنات حية أخرى ذات خصائص مماثلة لتحليل المجهر 4D11،12،13،14،15،16.
بالنسبة لتلك الدراسات التنموية، فإن تعطيل الجينات إما عن طريق علم الوراثة الأمامي أو العكسي يوفر دليلا على مشاركته في تكوين الأجنة. بمجرد أن يثبت أن الجين يلعب دورا في التنمية ، فإن الخطوة التالية هي تحديد دوره الدقيق في إنشاء خطة الجسم الصحيحة. التلطيخ المناعي هو النهج المختار لمعظم النماذج. توضح هذه التقنية المشاكل في تمايز الخلايا أو التعبير عن علامات محددة. ومع ذلك، فإن أحد القيود الرئيسية لهذا النهج هو أنه لا يوفر سوى رؤية ثابتة للتعبير عن علامة واحدة أو أكثر عند نقطة ثابتة في التطوير. لا يمكن الحصول على رؤية ديناميكية لهذه العلامات طوال فترة التطور إلا عن طريق تلطيخ الأجنة المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن إعادة بناء سلالة الخلايا في مثل هذه العينات الثابتة.
الفحص المجهري 4D هو نهج تكميلي لدراسة التطور الجنيني. تكشف هذه التقنية عن ديناميكيات التطوير بدقة على مستوى الخلية. أي عيب في الجنين مثل مشاكل في اتجاه المغزل ، وهجرة الخلايا ، موت الخلايا المبرمج ، ومواصفات مصير الخلية ، وما إلى ذلك ، سيظهر في فيلم 4D يمكن تصوره إلى الأمام والخلف ، وتحديده كميا وتسجيله من قبل الباحث. باستخدام هذه التقنية ، يمكن متابعة كل خلية في الجنين تقريبا حتى اللحظة التي يبدأ فيها الجنين في التحرك. الأجنة المعرضة للمجهر 4D مع الضوء المرئي فقط والبصريات نومارسكي لا تتكبد أضرارا ضوئية. يمكن أيضا إجراء عمليات المسح الفلوري داخل التسجيل للكشف عن متى وأين يتم التعبير عن الجين. يتم تحديد الأجنة التي تعاني من تلف ضوئي كبير من خلال تمديد دورة الخلية التي تسبب تشعيع قوي للأشعة فوق البنفسجية مقارنة بجنين سلالة WT القياسي. في هذه الحالة ، يمكن تقليل الضرر الضوئي عن طريق خفض شدة مصباح الأشعة فوق البنفسجية وزيادة حساسية الكاميرا أو وقت التعرض. يمكن أن تساعد الخصائص المورفولوجية والواسمات الجزيئية في توضيح التطور الجنيني لأي متحور.
من السهل تنفيذ نظام الفحص المجهري 4D في المختبر ، وبعد بعض الممارسة ، يتيح تحليلا لا مثيل له لديناميكيات الخلية وتتبع سلالات مزارع الخلايا والعينات الحية الشفافة على مستوى دقة كل خلية في مجال المجهر. لا يزال تتبع نسب الخلايا على صور DIC تتم معالجته يدويا. يستغرق الأمر وقتا طويلا ، وعلى الرغم من أن البرنامج يكتشف أخطاء النسب مثل فروع النسب المختلفة التي تميز نفس الخلية ، إلا أن الأخطاء ممكنة. في حين أن الكشف التلقائي عن الخلايا التي تحمل علامة GFP متطور بشكل جيد2 ، فإن برنامج تتبع السلالات التكميلي القائم على الخلايا غير المميزة وصور الضوء المرئي لا يزال في المرحلة المبكرة وغير مفيد حقا لتحليل الجنين الكامل. مما لا شك فيه أن تطبيق أنظمة التعرف على الصور في مجال الفحص المجهري للضوء المرئي سيحقق تقدما كبيرا في هذا المجال.

الفحص المجهري 4D هو نظام تسجيل متعدد البؤر بفاصل زمني يسمح للباحثين بتسجيل وقياس ديناميكيات الخلية للعينة البيولوجية مكانيا وبمرور الوقت. يمكن أن تخضع مزارع الخلايا أو الخمائر أو الأنسجة الحية لتحليل 4D ولكن هذه التقنية مناسبة بشكل خاص لتحليل تطور الأجنة الحية. تصل دقة هذا التحليل إلى مستوى كل خلية من خلايا الجنين. يمكن الكشف عن كل انقسام خلوي ، ويمكن تتبع حركات الخلايا بمرور الوقت. يتم تقييم مصائر الخلايا وفقا للموضع والشكل الذي تكتسبه الخلايا. يعزز استخدام بصريات نومارسكي تباين العينات الشفافة غير الملطخة باستخدام حزم ضوئية مستقطبة بشكل متعامد تتداخل في المستوى البؤري. تظهر الصور الناتجة ثلاثية الأبعاد ، مضاءة على جانب واحد.
تم تطوير طرق أخرى تعتمد على استخدام المجهر البؤري والحيوانات المعدلة وراثيا GFP للكشف التلقائي عن النوى وتوليد سلالات الخلايا 1,2. ميزة هذه الأنظمة واضحة: البرنامج يتجاوز إلى حد كبير الحاجة إلى وضع علامة يدويا على كل نواة على مدى فترة من الزمن (على الرغم من أن بعض الإشراف اليدوي مطلوب خلال المراحل المتأخرة). ومع ذلك ، فإن العمليات الخلوية التي تنطوي على تغييرات في شكل الخلية أو ديناميكيات الغشاء ، مثل تلك التي تحدث أثناء تمايز الخلايا أو الهجرة أو موت الخلايا المبرمج أو ابتلاع الجثة ، تظل مخفية كخلفية سوداء في صور النوى الموسومة بالفلورسنت.
في المقابل ، يظهر مجهر نومارسكي 4D (ويسمى أيضا مجهر DIC ، مجهر تباين التداخل التفاضلي) كلا من النوى وتغيرات شكل الخلية التي تحدث أثناء تطور النوع البري أو الحيوانات المتحولة. وهذا يسمح بتتبع نسب الخلايا باستخدام المجاهر القياسية، باستخدام الضوء المنقول فقط. ليست هناك حاجة عامة لاستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا إلا لإظهار أنماط تعبير محددة ، وفي هذه الحالة يمكن أن تكون عمليات المسح الفلورية متداخلة. لذلك ، يمكن أن يكون هذا هو النهج الأمثل للعديد من المختبرات التي تعمل على عمليات الخلايا الديناميكية مثل تكوين الأجنة أو موت الخلايا المبرمج الذي يمكن تسليط الضوء عليه تحت المجهر DIC3،4،5،6،7.
تتوفر العديد من البرامج المرنة وسهلة الاستخدام لالتقاط الصور المجهرية وإعادة بناء سلالات الخلايا ونماذج 3D ومسارات هجرة الخلايا وما إلى ذلك في العينة المسجلة. في تجربة قياسية ، يتم الحصول على الصور في سلسلة من المستويات البؤرية ، على مسافة ثابتة ، يعتمد عددها على سمك العينة. يمكن تحسين الدقة الزمنية للتحليل عن طريق زيادة تردد المسح. لا يوجد أي حد تقريبا لمدة التسجيل بخلاف سعة تخزين الكمبيوتر. على سبيل المثال، بالنسبة لتحليل تطور جنين C. elegans ، نحصل بشكل روتيني على صور على 30 مستوى بؤري (1 ميكرون خطوة لكل منها)، كل 30 ثانية لمدة 12 ساعة.
تم تطبيق هذه الأنظمة على تحليل العديد من الأجنة الحيوانية مثل Caenorhabditis elegans 8,9,10 و Drosophila melanogaster11 و nematode embryosالأخرى 12,13 و tardigrades14,15 وحتى أجنة الفئران المبكرة 16. الشرط الوحيد هو وجود جنين شفاف قادر على التطور على إعداد الشريحة تحت المجهر.
باختصار ، يعد الفحص المجهري 4D القائم على DIC مفيدا بشكل خاص ل 1) تحليل التطور الجنيني للحيوانات الصغيرة والشفافة: تتبع سلالة الخلايا ، ومسارات هجرة الخلايا ، وتوليد نماذج 3D ، وما إلى ذلك ؛ 2) تحديد أنماط التعبير الجيني ؛ 3) دراسة ديناميكيات زراعة الخلايا ، من الخميرة إلى الخلايا البشرية ؛ 4) تحليل ديناميات الأنسجة أو شظايا الجنين ؛ 5) تحديد كمي لحركية موت الخلايا وابتلاع الجثث ؛ و 6) إجراء تحليل السلالات المقارن على أساس الخصائص التنموية الجنينية. إذا كان هناك اهتمام بأي من هذه الموضوعات (أو مواضيع مماثلة) ، يمكن استخدام المجهر 4D.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Cell Lineage Tracing software</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Motorized microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td></tr><tr><td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td></tr></tbody></table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

المجهر 4D هو أداة لا تقدر بثمن لكشف عملية النمو الجنيني في الحيوانات المختلفة. على مدى العقود الماضية ، برزت Caenorhabditis elegans كواحدة من أفضل النماذج لدراسة التنمية. من وجهة نظر بصرية ، فإن حجمها وجسمها الشفاف يجعلان هذه الديدان الخيطية عينة مثالية للفحص المجهري DIC (تباين التداخل التفاضلي أو Nomarski). توضح هذه المقالة بروتوكولا لزراعة الديدان الخيطية C. elegans ، وإعداد وتركيب أجنة ، وإجراء الفحص المجهري 4D وتتبع نسب الخلايا. تعتمد هذه الطريقة على سجلات الفاصل الزمني متعدد البؤر لصور Nomarski وتحليلها باستخدام برامج محددة. تكشف هذه التقنية عن ديناميكيات النمو الجنيني على المستوى الخلوي. يمكن اكتشاف أي عيب جنيني في الطفرات ، مثل مشاكل في اتجاه المغزل أو هجرة الخلايا أو موت الخلايا المبرمج أو مواصفات مصير الخلية ، وتسجيلها بكفاءة. تقريبا كل خلية واحدة من الجنين يمكن متابعتها حتى اللحظة التي يبدأ فيها الجنين في التحرك. إن تتبع السلالة الخلوية الكاملة لجنين C. elegans بواسطة المجهر 4D DIC أمر شاق ، لكن استخدام برامج محددة يسهل هذه المهمة إلى حد كبير. بالإضافة إلى ذلك ، هذه التقنية سهلة التنفيذ في المختبر. المجهر 4D هو أداة متعددة الاستخدامات ويفتح إمكانية إجراء تحليل لا مثيل له للتطور الجنيني.

لتوصيف التطور الجنيني لمتحور C. elegans للجين gsr-1 ، الذي يشفر إنزيم الجلوتاثيون المختزل ، المطلوب لتجديد الجلوتاثيون المنخفض (GSH) ويشارك في الحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال في الديدان الخيطية ، أجرينا فحصا مجهريا رباعي الأبعاد لمتحور حذف gsr-1 (tm3574) وهو فقدان وظيفة أليل يسبب النمط الظاهري المبكر للاعتقال الجنيني18. تم زراعة كل من WT و gsr-1 (tm3574) المتحولة C. elegans الديدان الخيطية على ألواح NGM المزروعة ب E. coli OP50 كمصدر غذائي17. نمت ديدان gsr-1 (tm3574) على شكل متغاير الزيجوت عند 20 درجة مئوية لمدة جيلين ثم تم تحويل الديدان المتجانسة الزيجوت (القادرة على النمو حتى مرحلة البلوغ بفضل الحمل الأمومي) إلى 25 درجة مئوية للحضانة بين عشية وضحاها قبل تحليل الجنين. تم تحضين ألواح الدودة داخل صناديق من الورق المقوى لتجنب التكثيف (الشكل 1). تم قطع الديدان الخيطية الجرافية لاستخراج الأجنة الصغيرة.
لمقارنة التطور الجنيني للمتحور مقابل WT النمطي في ظل ظروف متطابقة ، تم وضع WT (كعنصر تحكم) وجنين gsr-1 (tm3574) على نفس المستحضر بجانب بعضهما البعض. تم تشغيل سير عمل المجهر 4D على مجهر مستقيم قياسي مزود بمحرك مجهز ببصريات DIC. كانت معلمات التسجيل المختارة في برنامج التحكم في المجهر هي: مكدسات z من 30 مستوى بؤري على مسافة ميكرون واحد لكل منها ، وفترات 30 ثانية بين بداية كل مكدس z و 1500 z-stacks (12.5 ساعة من التسجيل). تم ضبط درجة حرارة التسجيل إلى 25 درجة مئوية (سواء في الغرفة أو على مسرح المجهر) (الشكل 2).
بمجرد الانتهاء من التسجيل ، تم فتح ملف الصور ، وتم إعادة بناء سلالة الخلية باستخدام برنامج تتبع النسب بالنقر فوق نوى الخلية الموضحة في نافذة الفيديو (الشكل 4). تمت مقارنة سلالة الخلايا الجنينية الطافرة gsr-1 (tm3574) التي تم تتبعها مع سلالة C. elegans WT الموضحة في الخلفية. وكانت النتيجة الرئيسية هي الكشف عن تأخير تدريجي في دورة الخلية أثناء التطور الجنيني. ونتيجة لذلك ، تم القبض على الأجنة المتحولة في المراحل المتوسطة بينما تقدمت أجنة WT وأخيرا فقست كيرقات.
يمكن أن يكشف التحضير والمراقبة المباشرة للأجنة تحت المجهر أو التلطيخ المناعي بالأجسام المضادة ضد العلامات الجنينية المتأخرة عن وجود نسبة عالية من الأجنة الصغيرة في المتحور مقارنة ب WT. يمكن بعد ذلك استنتاج اعتقال الجنين باعتباره التفسير الأكثر معقولية. ومع ذلك ، لا يمكن إظهار الدليل المباشر والقياس الكمي الدقيق لتأخير دورة الخلية إلا بأناقة وسهولة وقياسه كميا من خلال تجربة الفحص المجهري 4D. يمكن أيضا تصور السمات المهمة الأخرى للتطور الجنيني مثل تمايز الخلايا أو موت الخلايا المبرمج (الشكل 5) بطريقة ديناميكية باستخدام الفحص المجهري 4D الذي يقدم تحليلا مفصلا لجوانب متعددة من التطور في تجربة واحدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> الشكل 1: الديدان الخيطية C. elegans تنمو تحت ظروف المختبر. تزرع الديدان الخيطية على ألواح NGM المزينة ببذور الإشريكية القولونية ، وتخزن في صناديق من الورق المقوى وتحضن إما عند 15 درجة مئوية أو 20 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> الشكل 2: لقطة شاشة لبرنامج تسجيل 4D المجهري. مثال على برنامجين مختلفين للتحكم في المجهر (A و B). تقوم هذه البرامج بإنشاء مهام سير عمل للتحكم في المجهر والتقاط الصور أثناء تسجيل المجهر 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> الشكل 3: صور متسلسلة لإعداد وسادة أجار وتركيب جنين C. elegans الذي يظهر. أ . أنابيب أجار المعدة. ب-ج. إعداد وسادة أجار. د. شريحة مملوءة جزئيا بالماء. ه. ختم الشريحة مع هلام البترول. و. الإعداد النهائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> الشكل 4: لقطات شاشة تسلسلية لبرنامج تتبع سلالات الخلايا. يسمح البرنامج بإعادة بناء سلالة الخلية الجنينية لدورة الخلية تأخير المتحور (يسار) و WT (يمين) C. elegans. A. خطوة مبكرة من التطور. ب-ج. يتطور كلا الجنينين بمرور الوقت. D. يتطور جنين WT بشكل صحيح ويبدأ في الاستطالة بينما يقبض المتحور. في جميع الحالات ، يعرض البرنامج نافذة الفيديو ونافذة النسب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> الشكل 5: شكل العدس المنكسر للخلايا الماصة في جنين C. elegans WT.  يمكن تقييم مصير الخلية ، الذي تحدده الخصائص المورفولوجية ، بواسطة الفحص المجهري 4D. تظهر الصورة جنين C. elegans في مرحلة الفول. تظهر الخلايا الحية نوى ناعمة الشكل محاطة بسيتوبلازم حبيبي. في المقابل ، تتكثف الخلايا الماصة (الأسهم الصفراء) وتعتمد شكلا يشبه العدس والانكساري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد وتركيب أجنة Caenorhabditis elegans ، وتسجيل التطور تحت مجهر 4D وتتبع سلالة الخلايا.

4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.6K Views.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد وتركيب أجنة Caenorhabditis elegans ، وتسجيل التطور تحت مجهر 4D وتتبع سلالة الخلايا.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

واحد الطول الموجي الظل التصوير من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; تقديرات تنقل القوة بما في ذلك

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Engineering

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

"تحليل حيود من العيش" على أساس فورييه ايليجانس كاينورهابديتيس

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neuroscience

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

رواية مقاييس لوصف الجنينية الاستطالة للنيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

واحد الطول الموجي الظل التصوير من

"تحليل حيود من العيش" على أساس فورييه ايليجانس كاينورهابديتيس

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

رواية مقاييس لوصف الجنينية الاستطالة للنيماتودا

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

الأساسية

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في