ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה חשוב מאוד לאבחון של היפרליפידמיה וחקירת טרשת עורקים. בפרוטוקול זה, נציג את השיטה הבסיסית באמצעות ultracentrifugation לבודד ליפופרוטאינים פלזמה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשתמש מיליליטר אחד של פלזמה כדי לבודד שבעה שברי ליפופרוטאין.
שברים אלה יכולים לשמש עבור שומנים, apolipoproteins, כמו גם מחקרים פונקציונליים שיטה זו יכולה להיות מיושמת עבור דגימות אנושיות ובעלי חיים לאבחון של דיסליפידמיה והמחלה הקשורה. התחל על ידי העברת מיליליטר אחד של פלזמה לתוך כל צינור ultracentrifuge פוליקרבונט. ואז לטעון את הצינורות ברוטור זווית קבועה צנטריפוגה הפלזמה ב 356, 000 פעמים G במשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
התאם את מיקום הלהב בכלי הפריסה של הצינור לרמה שבין השבר העליון לשבר התחתון. חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאסוף את החלק העליון, כ 200 microliters, לתוך צינור מיקרו חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה.
כוונן את עוצמת הקול הכוללת ל- 800 מיקרוליטרים על-ידי הוספת אותו פתרון צפיפות. להתאים את החלק התחתון לצפיפות של 1.02 גרם למיליליטר על ידי הוספת 58.9 microliters של 1.21 גרם לכל פתרון מיליליטר, ו 141.1 microliters של 1.02 גרם לכל פתרון מיליליטר עבור נפח כולל של מיליליטר אחד. לטעון צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356, 000 פעמים G במשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
המשך לאסוף שברים עליונים, להתאים את הצפיפות של שברים תחתונים, וצנטריפוגות עבור צפיפות שברים של 1.02, 1.04, 1.06, 1.08, 1.1, ו 1.21 גרם למיליליטר. עבור ultracentrifugation הסופי, צנטריפוגה ב 513, 000 פעמים G במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס. פרופילי ליפופרוטאין של ארנבים האכילו דיאטה סטנדרטית נורמלית או דיאטה כולסטרול גבוה מוצגים כאן.
ארנבים הם אוכלי עשב, ולכן רמות הפלזמה TC, TG ו- PL שלהם נמוכות בדרך כלל מאלה של בני אדם ועכברים. בארנבים רגילים הניזונים מתזונה מתזונה, TC מופץ בעיקר ב- HDL3 וב- LDL. בארנבים מסוג פראי בתזומה סטנדרטית רגילה, 39% מהפלזמה TG מופצים ב- VLDLs, ואילו 57% מ- PL הפלזמה כלול ב- HDL3.
כאשר ארנבים אותגרו עם דיאטה עתירת כולסטרול, הם פיתחו במהירות היפרכולסטרולמיה. פרופילי ליפופרוטאין שלהם התאפיינו על ידי הגבהה ניכרת של VLDLs. שבעה שברי ליפופרוטאין מארנבים מסוג בר האכילו או תקן רגיל או דיאטה עתירת כולסטרול נוהלו על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS ו דמיינו עם כתמי CBB.
בדיאטה עתירת כולסטרול, הן ApoB-100 והן תוכן ApoE ב- VLDLs, IDLs ו- LDLs היו גבוהים במידה ניכרת. סופג מערבי שימש להשוואת אפוליפופרוטאינים ופרופילי ליפופרוטאין של שלושה ארנבים היפרליפידמיים שונים: ארנבים מסוג בר שניזון מתזונת דיאטה עתירת כולסטרול, ארנבות נוקאאוט של ApoE וארנבות היפרליפידמיים וואטנבה הריטיבל עם מחסור בקולטן LDL. ה- ApoB המכיל חלקיקים של ארנבים מסוג בר הניזונים מתזונת דיאטה עתירת כולסטרול מאופיינים בתכולת ApoB-100 ו- ApoE מוגברת, ואילו ארנבי נוקאאוט של ApoE הראו עלייה של ApoB-48 יחד עם המראה של ApoA-1.
ארנבים Hyperlipidemic וואטנבה Heritable הם לקוי גנטית בתפקודי קולטן LDL, כך עלייה ניכרת של ApoB-100 ב LDLs מלווה ApoA-1 מופחת ב HDLs נצפתה, בדומה לחולי היפרכולסטרולמיה משפחתית אנושית. שחזור לדוגמה הוא הקריטי ביותר בהליך זה. כדי למזער את אובדן המדגם, יש להיזהר לאסוף שבר ולהמיס לחלוטין משקעים צמיגים בחלק התחתון.
לאחר איסוף של שבעה שברי ליפופרוטאין, דיאליזה נדרשת למיון. לאחר השלמת הדיאליזה, דגימות ליפופרוטאינים לניתוח באמצעות דף SDS, סופג מערבי, ומחקר מבוסס תאים. בסביבה הקלינית, ultracentrifugation בדרך כלל מפריד ליפופרוטאינים לארבעה שברים.
השיטה הנוכחית יכולה לבודד שבעה שברי ליפופרוטאינים, אשר מספק פרטים נוספים של ליפופרוטאינים לחקירה של היפרליפידמיה.
