L’analyse des lipoprotéines de plasma est très importante pour le diagnostic de l’hyperlipidémie et l’investigation de l’athérosclérose. Dans ce protocole, nous allons introduire la méthode de base en utilisant l’ultracentrifugation pour isoler les lipoprotéines plasmatiques. Cette méthode permet aux chercheurs d’utiliser un millilitre de plasma pour isoler sept fractions de lipoprotéines.
Ces fractions peuvent être utilisées pour les lipides, les apolipoprotéines, ainsi que des études bien fonctionnelles Cette méthode peut être appliquée pour des échantillons humains et animaux pour le diagnostic de la dyslipidémie et la maladie connexe. Commencez par transférer un millilitre de plasma dans chaque tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate. Ensuite, chargez les tubes dans un rotor à angle fixe et centrifugez le plasma à 356 000 fois G pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius.
Ajustez la position de la lame dans le trancheur de tube à un niveau entre la fraction supérieure et la fraction inférieure. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse et recueillir la fraction supérieure, environ 200 microlitres, dans un nouveau micro tube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante.
Réglez le volume total à 800 microlitres en ajoutant la même solution de densité. Ajustez la fraction inférieure à une densité de 1,02 gramme par millilitre en ajoutant 58,9 microlitres de 1,21 gramme par solution millilitre et 141,1 microlitres de 1,02 gramme par solution millilitre pour un volume total d’un millilitre. Chargez ces tubes dans le rotor à angle fixe et la centrifugeuse à 356 000 fois G pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius.
Continuer à recueillir les fractions supérieure, en ajustant la densité des fractions inférieures et en centrifugant pour les densités fractionnées de 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1 et 1,21 gramme par millilitre. Pour l’ultracentrifugation finale, centrifugeuse à 513 000 fois G pendant quatre heures à quatre degrés Celsius. Les profils de lipoprotéines des lapins nourris soit un régime alimentaire standard normal ou un régime riche en cholestérol sont montrés ici.
Les lapins sont herbivores, de sorte que leurs niveaux de plasma TC, TG et PL sont généralement inférieurs à ceux des humains et des souris. Chez les lapins normaux nourris au régime alimentaire, TC est principalement distribué en HDL3 et LDL. Chez les lapins de type sauvage selon un régime standard normal, 39 % des TG plasmatiques sont distribués dans les VLDL, tandis que 57 % du plasma PL est contenu dans hdl3.
Quand les lapins ont été contestés avec un régime riche en cholestérol, ils ont rapidement développé l’hypercholestérolémie. Leurs profils de lipoprotéine ont été caractérisés par l’élévation marquée des VLDLs. Sept fractions de lipoprotéine des lapins sauvages de type nourris soit une norme normale ou un régime à cholestérol élevé ont été exécutés sur un gel de polyacrylamide de SDD et visualisés avec la coloration de CBB.
Sur un régime à cholestérol élevé, les contenus d’ApoB-100 et d’ApoE dans VLDLs, IDLs, et LDLs ont été nettement élevés. Le ballonnement occidental a été employé pour comparer des profils d’apolipoprotéines et de lipoprotéines de trois lapins hyperlipidémiques différents : lapins sauvages de type de régime-cholestérol élevé-alimentés, lapins de KO d’ApoE, et lapins hyperlipidémiques héréditaires de Watanabe avec l’insuffisance de récepteur de LDL. L’ApoB contenant des particules de lapins de type sauvage nourris au régime riche en cholestérol se caractérise par une augmentation du contenu de l’ApoB-100 et de l’ApoE, tandis que les lapins ApoE knockout ont montré une augmentation de l’ApoB-48 avec l’apparition d’ApoA-1.
Les lapins hyperlipidémiques héréditaires watanabe sont génétiquement déficients dans les fonctions de récepteur de LDL, ainsi une augmentation marquée d’ApoB-100 dans des LDL accompagnée de l’ApoA-1 réduit dans HDLs a été observée, semblable aux patients familiaux humains d’hypercholestérolémie. La récupération de l’échantillon est la plus critique dans cette procédure. Pour minimiser la perte d’échantillon, il faut faire attention à recueillir la fraction et dissoudre complètement les précipitations visqueuses dans la fraction inférieure.
Après la collecte de sept fractions de lipoprotéine, la dialyse est nécessaire pour le tri. Une fois la dialyse terminée, les lipoprotéines sont analysées à l’aide de la page SDS, du ballonnement occidental et de l’étude cellulaire. Dans le cadre clinique, l’ultracentrifugation sépare habituellement les lipoprotéines en quatre fractions.
La méthode actuelle peut isoler sept fractions de lipoprotéines, qui fournit plus de détails des lipoprotéines pour l’investigation de l’hyperlipidémie.
