אספקת דם תקינה לשבלול חשובה ביותר למחלת השבלול מנייר, במיוחד לשמירה על פוטנציאל השבלול הפנימי, שהוא הכוח המניע החיוני לתנועת תאי שיער. פונקציה זו של זרימת הדם קשורה קשר הדוק עם צורות שונות של אובדן שמיעה. הבנה טובה יותר של זרימת הדם בשבלול תאפשר ניהול יעיל יותר של הפרעות שמיעה הנובעות מתפקוד לקוי של זרימת הדם.
עם זאת, מדידת זרימת דם ישירה היא מאוד מאוד מאתגרת בשל הקושי להעריך את האוזן הפנימית. טכניקות להערכת זרימת הדם של שבלול עדיין נמצאות בפיתוח. כאן אנו מדגימים את אחת השיטות האחרונות שהוקמו במעבדה שלנו חלון שרירים פתוח בהתאמה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה כדי לצמצם את זרימת הדם של שבלול במינים קטנים של בעלי חיים כגון עכבר.
ליישום טכניקה זו עם מודלים של מסה טרנסגנטית יש פוטנציאל לקידום המחקר כדי לפענח את הקשרים בין תפקוד השמיעה לבין הפתולוגיה הקשורה לזרימת דם שבלול בסיכון תוך-וסקולרי. הנהלים שלנו צריכים להתנהל בזהירות. בנוסף לדימום רגעי בגוף, יש לעקוב אחר הסימנים החיוניים של בעל החיים, כולל לחץ דם ודופק, במהלך הניתוח.
התחל על ידי איסוף כמילימטר אחד של דם בהפרין על ידי ניקור לב. צנטריפוגה הדם ב 3000 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הפלזמה, ולאחר מכן לשטוף את כדור תא הדם עם מיליליטר אחד של PBS שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ב 3000 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
תייג את תאי הדם עם מיליליטר אחד של 20 micromolar DiO או Dil ב- PBS, ודגרה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את תאי הדם המסומנים עם מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה שלוש פעמים ב 3000 פעמים G במשך שלוש דקות. יש להשהות את גלולת התא בהמטוקריט 30% עם כ-0.9 מיליליטר PBS לפני ההזרקה.
הכינו מכשירי ניתוח סטריליים ופלטפורמת הדמיה והניחו כרית חימום מתחת לווילון. עקוב אחר הרפלקס המסכן וטונוס השרירים הכללי של העכברים המורדמים כדי לבדוק את עומק ההרדמה. הניחו את בעל החיים על כרית החימום החמה וזנבו במערכת המוניטור לניטור לחץ דם ודופק.
לשמור על הטמפרטורה הרקטלית ב 37 מעלות צלזיוס ולרשום את לחץ הדם הסיסטולי של החיה, לחץ הדם הדיאסטולי, ולחץ דם ממוצע במצב מורדם. פתח את הבולה הטימפנית השמאלית באמצעות גישה צידית וגחונית תחת מיקרוסקופ סטריאו והותיר את הממברנה הטימפנית ואת המערכות ללא פגע. בצע חתך לאורך קו האמצע של צוואר החיה כאשר ראשה משותק כדי למזער את התנועה.
הסר את הבלוטה התת-מנדיבולרית השמאלית ואת הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי ולצרוב. אתר וחשוף את הבולה הגרמית על ידי זיהוי שריר הסטרנוקלידומסטואיד ועצב הפנים המשתרע קדמית לכיוון הבולה. פתח את הבולה הגרמית עם מחט 30 מד והסר בזהירות את העצם שמסביב באמצעות פינצטה כירורגית כדי לספק תצוגה ברורה של עורק השבלול והסטפדיאלי כאשר השוליים המדיאליים שלו מונחים על קצה גומחת החלון העגול וגורמים לעליונות קדמית לכיוון החלון הסגלגל.
השתמשו בלהב סכין קטן כדי לגרד את עצם הדופן הצידית בסיבוב האמצעי של שבלול העכבר במרחק של כ-1.25 מילימטרים מהפסגה, עד לסדיקת נקודה דקה. הסר את שבבי העצם עם ווים חוט קטן. כסה את חלון כלי השיט בכיסוי חתוך כדי שמירה על תנאים פיזיולוגיים תקינים וספק תצוגה אופטית להקלטת תמונות כלי השיט.
בצע חתך של סנטימטר אחד לאורך הווריד הספנוס הימני כדי לחשוף את כלי השיט. החדירו ברצף 100 מיקרוליטרים כל אחד מתמיסת FITC-Dextran ואת תרחיף תאי הדם לחיה דרך הווריד הספנוסי כדי לאפשר הדמיה של כלי הדם ומעקב אחר זרימת הדם. שימו לב לזרימת הדם בזמן אמת על צג וידאו חמש דקות לאחר ההזרקה.
דמיינו את כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך ובית מנורה המכיל מסנן עירור מרובה פסים ומסנן פליטה תואם. הקלט את הווידאו באמצעות מצלמת התקן מצומדת טעינה דיגיטלית בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה שרכשה יותר מ-350 תמונות לכל סרטון. כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות הזרימה.
מדוד את קוטר כלי השיט באמצעות תוכנה מתאימה וקבע את המרחק בין שתי נקודות קבועות על פני כלי השיט בתמונות שנרכשו. פתח את הווידאו של זרימת הדם בתוכנה ולהגדיר את קנה המידה של התמונות. עקוב אחר תאי הדם המוכתמים ב- DiO שנבחרו באמצעות פונקציית המעקב.
לאחר מכן השתמש במרחק שהתאים עברו ובמרווח הזמן בין מסגרות תמונה בסרטון לצורך חישוב אוטומטי של מהירות הזרימה. חשב את הזרימה הנפחית באמצעות המשוואה שניתנה בכתב היד של הטקסט. כדי ליצור את מודל החשיפה לרעש לפני הקלטת זרימת הדם, הניחו את בעלי החיים בכלובי רשת תיל וחשפו אותם לרעש פס רחב ברמת לחץ קול של 120 דציבלים בתא חשיפה לקול למשך שלוש שעות.
ואז לשלוש שעות נוספות למחרת. הקלט את זרימת הדם שבועיים לאחר החשיפה לרעש. לאחר חשיפה כירורגית של נימי השבלול בדופן הצדדית, תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של תאי דם המסומנים ב-DiL בכלי הדם המסומנים ב-FITC Dextran בוצעה דרך חלון כלי פתוח.
תאי דם המסומנים ב-DiL בכלי סטריה המסומנים ב-FITC Dextran מוצגים כאן. תאי דם המסומנים ב- FITC Dextran מראים כי צפיפות כלי הדם של הרצועה הספירלית דלילה יותר מזו של כלי הדם הצפוף יותר של Stria vascularis. IVM ברזולוציה גבוהה מראה את דפוסי זרימת הדם בקבוצות בקרה ורעש שנחשפו.
ניתן לראות את הדפוס המופרע של זרימת הדם בקבוצות החשופות לרעש. אנומליות כללו קוטר כלי שיט מופחת ושונות מוגברת בקוטר כלי השיט. מהירויות זרימת הדם בקבוצות הבקרה והרעש שנחשפו חושבו על ידי מעקב אחר שורשי תאי הדם המסומנים ב-DiO.
מהירות הדם והנפח בקבוצת הרעש שנחשפה היו נמוכים באופן משמעותי מאשר בקבוצת הביקורת. הקמה מוצלחת של חלון כלי הדם הפתוח דורשת רמה גבוהה של מיומנות כירורגית. יש להקפיד על הסרת העצם של דופן השבלול לרוחב.
