פרוטוקול זה שעבורו כל המצב הניסיוני אופטימיזציה בקפידה יכול לשמש כדי להקל על הטיות כימיות מוצלחות ויעילות של נוגדן DEC-205 אנטיגן OVA. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת בחירה גמישה של אנטיגן חלבון ונוגדן, וכי היא אינה מסתמכת על היתוך גנטי של רכיבים אלה. השתמשנו גם בפרוטוקול זה כדי ליצור מצומדים של חלבוני וירוס הפטיטיס C ואנטי DEC-205 עבור in vivo DC פילוח.
זה יכול להיות גם בעל ערך עבור גישות חיסון נגד הגידול. כדי להתחיל בייצור נגד DEC-205, resuspend נפח מיליליטר אחד של אחד עד חמישה מיליון הפשרה השתמר NLDC 145 תאים בתשעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס ISF-1 מדיום בתוספת עם 1%פניצילין וסטרפטומיצין, ולזרוע את התאים לתוך בקבוק תרבית תא 25 סנטימטר מרובע לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. כאשר התאים מגיעים ל-70% השפעה, העבירו את כל ההשעיה של התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ואוספים את התאים בצנטריפוגה.
resuspend הכדור ב 12 מיליליטר של 37 מעלות ISF-1 בינוני להשלים מחדש את התאים בבקבוק 75 ס"מ רבוע. לאחר 48 עד 72 שעות של תרבות, לפצל את התרבות המשתלבת 70% בין כל אחד משני צלוחיות חדשות 75 ס"מ מרובע ולהוסיף שישה מיליליטר של מדיום ISF-1 מלא טרי לכל בקבוקון. כאשר התרבויות מגיעות ל-70%, השתמש בצינורה של 10 מיליליטר כדי לשטוף את תחתיות הבקבוקים של תרבית התא ומשטחי התרבות עם מתלה התא כדי לאסוף את כל התאים ולהעביר 10 מיליליטר של כל מתלה תאי NLDC 145 מורחב לבקבוקי רולר PETG בודדים.
לאחר מכן להוסיף 140 מיליליטר של ISF-1 מלא בינוני לכל תרבות בקבוק רולר ותרבות בקבוקי רולר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 25 סיבובים לדקה במשך שלושה ימים. לטיהור נוגדנים מ-NLDC 145 supernatant, הניחו את קצה צינור הסיליקון לתוך הסופר-טבעית ואפשרו ל-800 מיליליטר של סופר-נט לרוץ במהירות דרך עמודת חלבון G ספרוז. עבור elution, להוסיף 100 microliters של 1.5 טוחנת Tris-HCL לתוך כל אחד מעשרים צינורות 1.5 מיליליטר ולהסיר את תקע הגומי מהעמוד.
מעבירים מיליליטר אחד של גליצין טוחן 0.1 לתא העליון של העמוד ואוספים את הנוגדן המכיל אלנט לאחד מצינורות 1.5 מיליליטר מוכנים וחוזרים על הפעולה עבור כל צינור. כאשר כל הנוגדנים נאספו והאולוטים המכילים נוגדנים אוגדו, סגור את תחתית צינור הדיאליזה באורך 20 ס"מ עם סגירת צינורות דיאליזה מתאימה, וצינור בזהירות את הנוגדנים אל הצינורות. סגור את החלק העליון של צינורות הדיאליזה עם מהדק שני ותקן את המהדק העליון של צינורות הדיאליזה לעמדה צפה.
מוסיפים מוט ערבוב מגנטי לתחבת PBS ומניחים את הכיס על מערבל מגנטי. לאחר דיאליזה לילית בארבע מעלות צלזיוס, פתחו מהדק אחד כדי לאפשר טעינה של הדיאליזה המלאה לרכז צנטריפוגלי עם 10 קילוDalton מולקולרית לניתוק משקל מולקולרי, וצנטריפוגה הרכז במשך 30 דקות ב 693 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. בסוף הסיבוב, לטעון את רכז צנטריפוגלי עם 10 מיליליטר של PBS עבור צנטריפוגה שנייה עד אחד הסופי עד 1.5 מיליליטר נפח של פתרון נוגדנים מתקבל.
כדי להטות את OVA לנוגדן נגד DEC-205, להוסיף 200 מיקרוליטרים של PBS בתוספת 500 מיקרוגרם של חלבון OVA, 240 מיקרוליטרים של פתרון TCEP-HCL מוכן טרי, ו 560 microliters של מים אולטרה-טחונים סטריליים לצינור 1.5 מיליליטר עבור דגירה של שעה וחצי בטמפרטורת החדר. במקביל, להוסיף 2.5 מיליגרם של אנטי DEC-205 ב 900 microliters של PBS ו 100 microliters של סולפו-SMCC מוכן טרי לצינור 1.5 מיליליטר שני עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 550 סיבובים לדקה בבלוק חימום. בסוף הדגירה, מניחים עמודי התפלה עם כובעים משוחררים ומעוותים את התחתית לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר, וצנטריפוגות העמודים כדי להסיר את הנוזל.
לאחר צנטריפוגה, מקם את העמודים בצינורות חדשים עם המכסות הוסרו, ולאט לאט לטעון את הנוגדנים sulfo-SMCC ו OVA TCEP-HCL פתרונות למרכז מיטת שרף קומפקטית של עמודה אחת לכל פתרון. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את העמודים ומיד לערבב את פתרונות הנוגדנים וה-OVA עם צנרת עדינה. העמיסו את התמיסה נגד DEC-205/OVA על רכז חלבונים צנטריפוגלי ומלאו את הרכז ב-PBS לנפח של 15 מיליליטר.
צנטריפוגות הרכז במשך חמש דקות ב 2, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר ולמלא את הרכז עם 10 מיליליטר נוסף של PBS. לאחר צנטריפוגה הריכוז במשך שמונה דקות לפחות תחת אותם תנאי צנטריפוגה, לאסוף בעדינות את המדגם המרוכז מהתא העליון. כדי לאמת את הצלחת ההטיה על ידי ניתוח כתם מערבי, לטעון aliquot מתוך כל מדגם על תקן חלבון על ג'ל SDS ולהפעיל את הג'ל על פי פרוטוקולי ניתוח SDS-PAGE סטנדרטיים.
לאחר סופגת ג'ל, להכתים את הממברנות עם נוגדנים מצומדים peroxidase חזרת כדי לזהות אנטי DEC-205 או OVA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן ניתן לנתח את הממברנות לנוכחות החלבון המתאים בכל דגימה. כדי לאמת את ההצלחה של ההטיה על ידי ELISA, לצפות צלחת ELISA 96-well מתאים עם 100 microliters של נוגדן אנטי OVA לבאר לדלל באופן סדרתי נגד DEC-205/OVA ביחס אחד עד שניים חוסם חוצץ כדי לקבל דילול מ 6 מיקרוגרם למיליליטר ל 93.8 ננוגרם למיליליטר.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל דילול לבארות המתאימות של הצלחת מצופה הנוגדנים לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של נוגדן peroxidase חזרת מצומד נגד אנטי DEC-205 / OVA מצומד לצלחת עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של מצע peroxidase חזרת לכל באר כדי לאפשר ניתוח של תגובת הצבע על ידי ספקטרופוטומטריה. ניתוח כתם מערבי מקביל יכול לשמש כדי לזהות הן OVA מצומד, כמו גם נגד DEC-205 מצומד.
כתמים עבור OVA יאפשרו זיהוי של עודף חינם OVA אם קיים, והכתמה עבור אנטי DEC-205 מאמת את ההצלחה של ההטיה באמצעות עלייה במשקל המולקולרי בין עירום נגד DEC-205 ואת מצומד. ELISA יכול לשמש גם כדי להעריך את ההצלחה של ההטיה עם קשר חיובי בין האות שזוהה ואת כמות ניתוח של חלבון המציין את הדור המוצלח של אנטי DEC-205/OVA הטיות. ציטומטריית זרימה וניתוח חיסוני מראים בבירור כי הליבה נגד DEC-205 קושרת ביעילות תאים חד-פעמיים ממקורות מח עצם.
חיסון עם אנטי-DEC-205/OVA בשילוב עם אדג'ובנט גרם לעלייה בטיטרים IgG ספציפיים ל- OVA במקבלי עכברים בהשוואה לחיסון עם OVA ואדג'ובנט בלבד. יתר על כן, אנטי-DEC-205/OVA ביעילות גורמת לתגובות תאי T ספציפיות יתר על המידה של CD4 ו- CD8 עם תגובות תאי T אנטי-DEC-205/OVA-חיוביות ל- CD8 העולות באופן משמעותי על זה שנגרם על ידי OVA בלבד. עבור הטיות מוצלחות של אנטיגן OVA נוגדן נגד DEC-205, חשוב להכין את החומרים כפי שהודגם ולבצע את שלבי ההטיה בתנאים עקביים.
לאחר הטיות מוצלחות של האנטיגן והנוגדן, גישות רבות לאחר מכן אפשריות, כולל ניתוח מחייב וגיוס של פתוגן או חסינות הקשורה לגידול ב vivo.
