Este protocolo para o qual toda a condição experimental foi cuidadosamente otimizada pode ser usado para facilitar uma conjugação química bem sucedida e eficiente do anticorpo DEC-205 ao antígeno OVA. As principais vantagens dessa técnica são que permite uma seleção flexível do antígeno e anticorpos proteicos, e que não depende da fusão genética desses componentes. Também usamos este protocolo para gerar conjugados de proteínas do vírus da hepatite C e anti-DEC-205 para segmentação in vivo DC.
Isso também pode ser valioso para abordagens de vacinação anti-tumor. Para iniciar a produção anti-DEC-205, resuspenque um volume de um mililitro de uma a cinco milhões de células NLDC 145 conservadas em nove mililitros de 37 graus Celsius ISF-1 médio suplementado com penicilina de 1%e estreptomicina, e semeou as células em um frasco de cultura celular de 25 centímetros quadrados para incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Quando as células atingirem 70% de confluência, transfira toda a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e colete as células por centrifugação.
Resuspenque a pelota em 12 mililitros de meio ISF-1 completo fresco de 37 graus e re-emplaque as células em um frasco de 75 centímetros quadrados. Após 48 a 72 horas de cultura, divida a cultura 70% confluente entre cada um dos dois novos frascos de 75 centímetros quadrados e adicione seis mililitros de meio ISF-1 completo fresco a cada frasco. Quando as culturas atingirem 70% de confluência, use uma pipeta de 10 mililitros para lavar os fundo do frasco de cultura celular e superfícies de cultura com a suspensão celular para coletar todas as células e transferir 10 mililitros de cada suspensão celular NLDC 145 expandida para garrafas de rolo PETG individuais.
Em seguida, adicione 140 mililitros de meio ISF-1 completos a cada cultura de garrafa de rolo e cultura as garrafas de rolo a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono e 25 rodadas por minuto durante três dias. Para purificação de anticorpos do nldc 145 supernante, coloque a extremidade de um tubo de silício no béquer recheado de supernasce e permita que 800 mililitros de supernante corram em sentido baixo através de uma coluna protein G Sepharose. Para eluição, adicione 100 microlitres de 1,5 molar Tris-HCL em cada um dos vinte tubos de 1,5 mililitro e remova o plugue de borracha da coluna.
Transfira um mililitro de 0,1 glicina molar para a câmara superior da coluna e colete o anticorpo contendo eluent em um dos tubos preparados de 1,5 mililitro e repita para cada tubo. Quando todo o anticorpo tiver sido coletado e as eluções contendo anticorpos tiverem sido agrupadas, feche o fundo de uma tubulação de diálise de 20 centímetros de comprimento com um fechamento apropriado de tubos de diálise, e cuidadosamente pipeta a eluição de anticorpos na tubulação. Feche a parte superior da tubulação de diálise com um segundo grampo e fixe o grampo superior da tubulação de diálise em um suporte flutuante.
Adicione uma barra de agitação magnética a um béquer de PBS e coloque o béquer em um agitador magnético. Após a diálise durante a noite a quatro graus Celsius, abra um grampo para permitir o carregamento do dialiseto completo a um concentrador centrífuga com um corte de peso molecular de 10 quiloDalton, e centrifugar o concentrador por 30 minutos a 693 vezes G e quatro graus Celsius. No final do giro, carregue o concentrador centrífuga com 10 mililitros de PBS para uma segunda centrifugação até que um volume final de 1,5 mililitro de solução de anticorpos seja obtido.
Para conjugar OVA ao anticorpo anti-DEC-205, adicione 200 microliters de PBS suplementados com 500 microgramas de proteína OVA, 240 microliters de uma solução TCEP-HCL recém-preparada e 560 microliters de água ultrapura estéril a um tubo de 1,5 mililitro para uma incubação de 1,5 horas em temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, adicione 2,5 miligramas de anti-DEC-205 em 900 microliters de PBS e 100 microliters de sulfo-SMCC recém-preparado a um segundo tubo de 1,5 mililitro para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius a 550 rotações por minuto em um bloco de aquecimento. No final das incubações, coloque colunas desalagem com tampas soltas e torcidos de fundo em tubos cônicos individuais de 15 mililitros, e centrifugar as colunas para remover o líquido.
Após a centrifugação, coloque as colunas em novos tubos com as tampas removidas e carregue lentamente as soluções de anticorpo sulfo-SMCC e OVA TCEP-HCL para o centro do leito de resina compacta de uma coluna por solução. Após a centrifugação, descarte as colunas e misture imediatamente as soluções de anticorpos e OVA com tubulação suave. Carregue a solução anti-DEC-205/OVA em um concentrador de proteína centrífuga e encha o concentrador com PBS a um volume de 15 mililitros.
Centrifugar o concentrador por cinco minutos a 2.000 vezes g e temperatura ambiente e encher o concentrador com mais 10 mililitros de PBS. Depois de centrifugar a concentração por pelo menos oito minutos sob as mesmas condições centrífugas, colecione suavemente a amostra concentrada da câmara superior. Para verificar o sucesso da conjugação pela análise de manchas ocidentais, carregue uma alíquota de cada amostra em um padrão de proteína em um gel SDS e execute o gel de acordo com os protocolos padrão de análise SDS-PAGE.
Após a mancha de gel, colorique as membranas com anticorpos conjugados peroxidase de rabanete para detectar anti-DEC-205 ou OVA de acordo com os protocolos padrão. As membranas podem então ser analisadas para a presença da respectiva proteína em cada amostra. Para verificar o sucesso da conjugação pela ELISA, cubra uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 microlitres do anticorpo anti-OVA por poço e dilui o anti-DEC-205/OVA em uma razão de um a dois e bloqueando o buffer para obter diluições de seis microgramas por mililitro a 93,8 nanogramas por mililitro.
Adicione 100 microlitres de cada diluição aos poços apropriados da placa revestida de anticorpos para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 100 microliters de anticorpo conjugado peroxidase de rabanete contra o conjugado anti-DEC-205/OVA à placa para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, em seguida, adicione 50 microliters de substrato de peroxidase de rabanete a cada poço para permitir a análise da reação de cor por espectrometphotoria. A análise paralela da mancha ocidental pode ser usada para detectar tanto oVA conjugado quanto anti-DEC-205 conjugado.
A coloração para OVA permitiria a detecção de OVA livre em excesso se presente, e a coloração para anti-DEC-205 verifica o sucesso da conjugação através de um aumento no peso molecular entre o anti-DEC-205 nu e o conjugado. A ELISA também pode ser utilizada para avaliar o sucesso da conjugação com uma associação positiva entre o sinal detectado e a quantidade analisada de proteína indicando a geração bem sucedida de conjugantes anti-DEC-205/OVA. A análise de citometria e imunofluorescência do fluxo mostra claramente que o núcleo anti-DEC-205 liga eficientemente células CD11c-positivas derivadas da medula óssea.
A vacinação com anti-DEC-205/OVA em conjunto com o adjuvante induz um aumento de títulos de IgG específicos de OVA em receptores de camundongos em comparação com a vacinação com OVA e adjuvante sozinho. Além disso, o anti-DEC-205/OVA induz eficientemente respostas de células T super-específicas cd4 e CD8 positivo com as respostas anti-DEC-205/OVA-induced CD8-positive T-cell responses significativamente superiores às induzidas apenas pelo OVA. Para uma conjugação bem sucedida de antígeno OVA com anticorpo anti-DEC-205, é importante preparar os materiais como demonstrado e executar as etapas de conjugação em condições consistentes.
Após a conjugação bem sucedida do antígeno e do anticorpo, inúmeras abordagens subsequentes são possíveis, incluindo análise de vinculação e indução de patógeno ou imunidade relacionada ao tumor in vivo.
