Ce protocole pour lequel toutes les conditions expérimentales ont été soigneusement optimisées peut être utilisé pour faciliter une conjugaison chimique réussie et efficace de l’anticorps DEC-205 à l’antigène OVA. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet une sélection flexible de l’antigène protéique et de l’anticorps, et qu’elle ne repose pas sur la fusion génétique de ces composants. Nous avons également utilisé ce protocole pour générer des conjugués de protéines du virus de l’hépatite C et d’anti-DEC-205 pour le ciblage IN VIVO DC.
Cela pourrait également être utile pour les approches de vaccination anti-tumorale. Pour commencer la production anti-DEC-205, resusciter un volume d’un millilitre d’un à cinq millions de cellules NLDC 145 cryoconservées décongelées dans neuf millilitres de milieu ISF-1 de 37 degrés Celsius complété par 1% de pénicilline et de streptomycine, et ensemencer les cellules dans une fiole de culture cellulaire de 25 centimètres carrés pour une incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Lorsque les cellules atteignent 70% de confluence, transférez toute la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et collectez les cellules par centrifugation.
Remettez en suspension la pastille dans 12 millilitres de milieu ISF-1 frais complet de 37 degrés et recollez les cellules dans une fiole de 75 centimètres carrés. Après 48 à 72 heures de culture, divisez la culture confluente à 70% entre chacune des deux nouvelles fioles de 75 centimètres carrés et ajoutez six millilitres de milieu ISF-1 frais complet à chaque flacon. Lorsque les cultures atteignent 70 % de confluence, utilisez une pipette de 10 millilitres pour rincer le fond de la fiole de culture cellulaire et les surfaces de culture avec la suspension cellulaire afin de recueillir toutes les cellules et de transférer 10 millilitres de chaque suspension cellulaire NLDC 145 expansée dans des bouteilles à rouleaux PETG individuelles.
Ajoutez ensuite 140 millilitres de milieu ISF-1 complet à chaque culture de bouteille à rouleaux et cultivez les bouteilles à rouleaux à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 25 tours par minute pendant trois jours. Pour la purification des anticorps du surnageant NLDC 145, placez l’extrémité d’un tube de silicium dans le bécher rempli de surnageants et laissez 800 millilitres de surnageant circuler goutte à goutte à travers une colonne de sépharose de protéine G. Pour l’élution, ajoutez 100 microlitres de Tris-HCL de 1,5 molaire dans chacun des vingt tubes de 1,5 millilitre et retirez le bouchon en caoutchouc de la colonne.
Transférer un millilitre de glycine molaire 0,1 dans la chambre supérieure de la colonne et recueillir l’éluant contenant l’anticorps dans l’un des tubes de 1,5 millilitre préparés et répéter pour chaque tube. Lorsque tous les anticorps ont été collectés et que les élutions contenant des anticorps ont été regroupées, fermez le fond d’un tube de dialyse de 20 centimètres de long avec une fermeture de tube de dialyse appropriée et pipetez soigneusement l’élution d’anticorps dans le tube. Fermez le haut du tube de dialyse avec une deuxième pince et fixez la pince supérieure du tube de dialyse à un support flottant.
Ajouter une barre d’agitation magnétique à un bécher de PBS et placer le bécher sur un agitateur magnétique. Après une dialyse de nuit à quatre degrés Celsius, ouvrez une pince pour permettre le chargement du dialysat complet dans un concentrateur centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 10 kilodatons, et centrifugez le concentrateur pendant 30 minutes à 693 fois G et quatre degrés Celsius. À la fin du spin, chargez le concentrateur centrifuge de 10 millilitres de PBS pour une deuxième centrifugation jusqu’à l’obtention d’un volume final à 1,5 millilitre de solution d’anticorps.
Pour conjuguer l’OVA à l’anticorps anti-DEC-205, ajoutez 200 microlitres de PBS complétés par 500 microgrammes de protéine OVA, 240 microlitres d’une solution de TCEP-HCL fraîchement préparée et 560 microlitres d’eau ultrapure stérile dans un tube de 1,5 millilitre pour une incubation de 1,5 heure à température ambiante. Dans le même temps, ajoutez 2,5 milligrammes d’anti-DEC-205 dans 900 microlitres de PBS et 100 microlitres de sulfo-SMCC fraîchement préparés dans un deuxième tube de 1,5 millilitre pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius à 550 tours par minute dans un bloc chauffant. À la fin des incubations, placez les colonnes de dessalement avec des bouchons desserrés et des fonds tordus dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et centrifugez les colonnes pour éliminer le liquide.
Après centrifugation, placez les colonnes dans de nouveaux tubes avec les bouchons enlevés et chargez lentement les solutions d’anticorps sulfo-SMCC et OVA TCEP-HCL au centre du lit de résine compact d’une colonne par solution. Après la centrifugation, jeter les colonnes et mélanger immédiatement les solutions d’anticorps et d’OVA avec un pipetage doux. Chargez la solution anti-DEC-205/OVA sur un concentrateur de protéines centrifuges et remplissez le concentrateur de PBS jusqu’à un volume de 15 millilitres.
Centrifugez le concentrateur pendant cinq minutes à 2 000 fois G et à température ambiante et remplissez le concentrateur avec 10 millilitres supplémentaires de PBS. Après avoir centrifugé la concentration pendant au moins huit minutes dans les mêmes conditions de centrifugeuse, prélever doucement l’échantillon concentré dans la chambre supérieure. Pour vérifier le succès de la conjugaison par analyse par transfert Western, chargez une aliquote de chaque échantillon sur un étalon de protéine sur un gel SDS et exécutez le gel selon les protocoles d’analyse SDS-PAGE standard.
Après le buvard de gel, colorez les membranes avec des anticorps conjugués à la peroxydase de raifort pour détecter l’anti-DEC-205 ou OVA selon les protocoles standard. Les membranes peuvent ensuite être analysées pour la présence de la protéine respective dans chaque échantillon. Pour vérifier le succès de la conjugaison par ELISA, enduisez une plaque ELISA appropriée de 96 puits avec 100 microlitres de l’anticorps anti-OVA par puits et diluez en série l’anti-DEC-205/OVA à un rapport de un à deux et bloquez le tampon pour obtenir des dilutions de six microgrammes par millilitre à 93,8 nanogrammes par millilitre.
Ajouter 100 microlitres de chaque dilution aux puits appropriés de la plaque recouverte d’anticorps pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres d’anticorps conjugués peroxydase de raifort contre le conjugué anti-DEC-205/OVA à la plaque pour une incubation d’une heure à température ambiante, puis ajouter 50 microlitres de substrat de peroxydase de raifort à chaque puits pour permettre l’analyse de la réaction de couleur par spectrophotométrie. L’analyse parallèle par transfert Western peut être utilisée pour détecter à la fois les OVA conjugués et les anti-DEC-205 conjugués.
La coloration pour OVA permettrait la détection d’un excès d’OVA libre s’il est présent, et la coloration pour anti-DEC-205 vérifie le succès de la conjugaison par une augmentation du poids moléculaire entre l’anti-DEC-205 nu et le conjugué. ELISA peut également être utilisé pour évaluer le succès de la conjugaison avec une association positive entre le signal détecté et la quantité analysée de protéine indiquant la génération réussie d’un conjugué anti-DEC-205/OVA. La cytométrie en flux et l’analyse par immunofluorescence montrent clairement que le noyau anti-DEC-205 lie efficacement les cellules CD11c positives dérivées de la moelle osseuse.
La vaccination avec anti-DEC-205/OVA en conjonction avec un adjuvant induit une augmentation des titres d’IgG spécifiques à l’OVA chez les receveurs de souris par rapport à la vaccination avec OVA et adjuvant seul. De plus, l’anti-DEC-205/OVA induit efficacement des réponses surspécifiques des lymphocytes T CD4 et CD8 positifs avec les réponses des lymphocytes T CD8 positifs induites par l’anti-DEC-205/OVA dépassant de manière significative celles induites par l’OVA seul. Pour une conjugaison réussie de l’antigène OVA à l’anticorps anti-DEC-205, il est important de préparer les matériaux comme démontré et d’effectuer les étapes de conjugaison dans des conditions cohérentes.
Après une conjugaison réussie de l’antigène et de l’anticorps, de nombreuses approches ultérieures sont possibles, y compris l’analyse de liaison et l’induction d’une immunité pathogène ou liée à la tumeur in vivo.
