يمكن استخدام هذا البروتوكول الذي تم تحسين جميع الحالات التجريبية بعناية لتسهيل اقتران كيميائي ناجح وفعال للأجسام المضادة DEC-205 مستضد OVA. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باختيار مرن لمضاد البروتين والأجسام المضادة ، وأنها لا تعتمد على الاندماج الجيني لهذه المكونات. كما استخدمنا هذا البروتوكول لتوليد مترافقات من بروتينات فيروس التهاب الكبد C ومضادات DEC-205 لاستهداف في الجسم الحي DC.
وبالمثل، يمكن أن يكون هذا قيما لنهج التطعيم المضاد للورم. لبدء إنتاج مضاد DEC-205 ، أعيد إنفاق حجم ملليلتر واحد من 1 إلى 5 ملايين خلية NLDC 145 المحفوظة بالتبريد المذاب في تسع ملليلترات من 37 درجة مئوية ISF-1 متوسطة تكملها 1٪ البنسلين والستريبتوميسين ، وزرع الخلايا في قارورة زراعة خلايا مساحتها 25 سنتيمترا مربعا لاحتضانها عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪، نقل تعليق الخلية بأكمله إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend بيليه في 12 ملليلتر من الطازجة كاملة 37 درجة ISF-1 المتوسطة وإعادة لوحة الخلايا في قارورة 75 سنتيمترا مربعا. بعد 48 إلى 72 ساعة من الثقافة، تقسيم ثقافة التقاء 70٪ بين كل من اثنين من قوارير جديدة 75 سم مربع وإضافة ستة ملليلتر من ISF-1 كاملة جديدة المتوسطة إلى كل قارورة. عندما تصل الثقافات إلى التقاء 70٪، استخدم ماصة 10 ملليلتر لطرد قيعان قارورة ثقافة الخلية وأسطح الثقافة مع تعليق الخلية لجمع جميع الخلايا ونقل 10 ملليلتر من كل تعليق خلية NLDC 145 الموسع إلى زجاجات بكرة PETG الفردية.
ثم أضف 140 ملليلتر من ISF-1 المتوسطة كاملة لكل ثقافة زجاجة الأسطوانة والثقافة زجاجات الأسطوانة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 25 طلقة في الدقيقة الواحدة لمدة ثلاثة أيام. لتنقية الأجسام المضادة من NLDC 145 supernatant، ضع نهاية أنبوب السيليكون في الكأس المليئة بالناطقة والسماح 800 ملليلتر من supernatant لتشغيل dropwise من خلال عمود البروتين G Sepharose. ل elution، إضافة 100 ميكرولتر من 1.5 الضرس تريس-HCL في كل من أنابيب 1.5 ملليلتر وعشرين وإزالة المكونات المطاطية من العمود.
نقل ملليلتر واحد من 0.1 الجليسين المولاري إلى الغرفة العليا من العمود وجمع الأجسام المضادة التي تحتوي على eluent في واحدة من أنابيب 1.5 ملليلتر المعدة وكرر لكل أنبوب. عندما يتم جمع جميع الأجسام المضادة وتم تجميع الوضوء المحتوي على الأجسام المضادة ، أغلق الجزء السفلي من أنابيب غسيل الكلى بطول 20 سنتيمترا مع إغلاق أنابيب غسيل الكلى المناسب ، وماصة الوضوء المضاد بعناية في الأنابيب. أغلق الجزء العلوي من أنابيب غسيل الكلى بمشبك ثان وقم بإصلاح المشبك العلوي لأنابيب غسيل الكلى إلى حامل عائم.
إضافة شريط ضجة المغناطيسي إلى كوب من برنامج تلفزيوني ووضع الكأس على stirrer المغناطيسي. بعد غسيل الكلى بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، فتح المشبك واحد للسماح بتحميل dialysate كاملة إلى مكثف الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 10 كيلودالتون، والطرد المركزي المكثف لمدة 30 دقيقة في 693 مرة G وأربع درجات مئوية. في نهاية الدوران، قم بتحميل المكثف الطرد المركزي مع 10 ملليلتر من PBS للطرد المركزي الثاني حتى يتم الحصول على حجم نهائي واحد إلى 1.5 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة.
لإقران OVA بالأجسام المضادة ل DEC-205، أضف 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مكمل ب 500 ميكروغرام من بروتين OVA، و240 ميكرولتر من محلول TCEP-HCL الذي تم إعداده حديثا، و560 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء العقيمة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لمدة 1.5 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة. في الوقت نفسه ، أضف 2.5 ملليغرام من مضاد DEC-205 في 900 ميكرولتر من PBS و 100 ميكرولتر من sulfo-SMCC المعدة حديثا إلى أنبوب ثاني 1.5 ملليلتر لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 550 ثورة في الدقيقة في كتلة التدفئة. في نهاية الحضانات، ضع أعمدة تحلية مع قبعات خففت والملتوية قبالة قيعان في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية، والطرد المركزي الأعمدة لإزالة السائل.
بعد الطرد المركزي، ضع الأعمدة في أنابيب جديدة مع إزالة القبعات، ثم قم بتحميل حلول sulfo-SMCC وOVA TCEP-HCL للأجسام المضادة ببطء إلى مركز سرير الراتنج المضغوط لعمود واحد لكل حل. بعد الطرد المركزي، تجاهل الأعمدة ومزج فورا الأجسام المضادة وحلول OVA مع pipetting لطيف. قم بتحميل محلول مضاد DEC-205/OVA على مركز بروتين طرد مركزي وملء المكثف مع PBS إلى حجم 15 ملليلتر.
الطرد المركزي المكثف لمدة خمس دقائق في 2000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة وملء المكثف مع 10 ملليلتر إضافية من برنامج تلفزيوني. بعد الطرد المركزي التركيز لمدة ثماني دقائق على الأقل في ظل ظروف الطرد المركزي نفسه، وجمع بلطف العينة المركزة من الغرفة العليا. للتحقق من نجاح اقتران من قبل تحليل لطخة الغربية، تحميل aaliquot من كل عينة على معيار البروتين على هلام SDS وتشغيل هلام وفقا لبروتوكولات تحليل SDS-PAGE القياسية.
بعد النشاف هلام، وصمة عار الأغشية مع الأجسام المضادة المقترنة الفجل peroxidase للكشف عن المضادة DEC-205 أو OVA وفقا للبروتوكولات القياسية. ويمكن بعد ذلك تحليل الأغشية لوجود البروتين المعني في كل عينة. للتحقق من نجاح اقتران ELISA ، قم بتغليف لوحة ELISA مناسبة من 96 جيدا مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة OVA لكل بئر وتمييع مضاد DEC-205/OVA بشكل متسلسل بنسبة 1 إلى 2 ومنع العازلة للحصول على المخففات من ستة ميكروغرام لكل ملليلتر إلى 93.8 نانوغرام لكل ملليلتر.
أضف 100 ميكرولتر من كل تمييع إلى الآبار المناسبة للوح المغلف بالأجسام المضادة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة الفجل peroxidase ضد المضادة DEC-205/OVA المصاحبة إلى لوحة لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة البيروكسيديز الفجل إلى كل بئر للسماح بتحليل رد فعل اللون عن طريق قياس الطيف. يمكن استخدام تحليل لطخة الغربية الموازية للكشف عن كل من OVA المترافقة وكذلك مكافحة DEC-205 المترافقة.
تلطيخ لOVA من شأنه أن يسمح للكشف عن OVA الحرة الزائدة إذا كان موجودا، وتلطيخ لمكافحة DEC-205 يتحقق من نجاح اقتران من خلال زيادة في الوزن الجزيئي بين عارية المضادة DEC-205 والموازية. ويمكن أيضا أن تستخدم ELISA لتقييم نجاح الاقتران مع وجود علاقة إيجابية بين إشارة الكشف عن وكمية تحليل البروتين مما يدل على نجاح جيل المضادة DEC-205/OVA المترافق. تدفق قياس الخلايا وتحليل immunofluorescence تظهر بوضوح أن الأساسية المضادة DEC-205 يربط بكفاءة خلايا CD11c إيجابية المشتقة من نخاع العظام.
التطعيم مع المضادة DEC-205/OVA بالتزامن مع المساعد يؤدي إلى زيادة في OVA محددة IgG titers في المتلقين الماوس مقارنة مع التطعيم مع OVA وم المساعدة وحدها. وعلاوة على ذلك، فإن مضادات DEC-205/OVA تحفز بكفاءة استجابات الخلايا التائية الإيجابية CD4 وCD8 مع استجابات الخلايا التائية الإيجابية CD8 المضادة DEC-205/OVA التي تتجاوز إلى حد كبير تلك الناجمة عن OVA وحدها. من أجل نجاح اقتران مستضد OVA بالأجسام المضادة المضادة DEC-205 ، من المهم إعداد المواد كما هو موضح وتنفيذ خطوات التواؤم في ظل ظروف متسقة.
بعد اقتران ناجح للمضاد والأجسام المضادة ، من الممكن اتباع العديد من النهج اللاحقة ، بما في ذلك التحليل الملزم وتحريض المناعة الممرضة أو المرتبطة بالورم في الجسم الحي.
