모든 실험 조건이 신중하게 최적화된 이 프로토콜은 OVA 항원에게 DEC-205 항체의 성공적이고 효율적인 화학적 활용을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 항원 및 항체의 유연한 선택을 허용하고, 이러한 성분의 유전 적 융합에 의존하지 않는다는 것입니다. 우리는 또한 생체 내 DC 표적화를 위해 C형 간염 바이러스 단백질 및 반대로 DEC-205의 접합을 생성하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다.
이것은 마찬가지로 항 종양 예방 접종 접근에 가치가있을 수 있습니다. 반DEC-205 생산을 시작하려면, 1~500만 개의 해동 된 극저온 으로 보존된 NLDC 145 세포는 섭씨 37도ISF-1 배지에서 1%페니실린과 연쇄상 구균으로 보충하고, 세포를 37°C에서 배양하고 5%의 이산화탄소를 2시간 동안 배양하기 위해 세포를 시드한다. 세포가 70%의 합류에 도달하면 전체 세포 현탁액을 15밀리리터 원문 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.
펠릿을 12밀리리터의 신선한 완전한 37도 ISF-1 배지로 재보페판하고 75 평방 센티미터 플라스크에서 세포를 다시 플레이트한다. 48~72시간의 문화가 끝나면 70%의 컨실린 문화를 각각 75평방센티미터의 플라스크로 나누고, 각 플라스크에 6밀리리터의 신선한 완전한 ISF-1 배지를 추가합니다. 배양이 70%에 도달하면 10밀리리터 파이펫을 사용하여 세포 배양 플라스크 바닥과 배양 표면을 세포 현탁액으로 플러시하여 모든 세포를 수집하고 확장된 각 NLDC 145 셀 서스펜션의 10 밀리리터를 개별 PETG 롤러 병으로 전송합니다.
그런 다음 각 롤러 병 문화에 140 밀리리터의 완전한 ISF-1 배지를 추가하고 3 일 동안 37섭씨 37도, 이산화탄소 5 %, 분당 25 라운드에서 롤러 병을 배양합니다. NLDC 145 상체체로부터의 항체 정제를 위해 실리콘 튜브의 끝을 상체 채워진 비커에 넣고 800 밀리리터의 슈퍼나트리터가 단백질 G 세파로즈 컬럼을 통해 드롭방향으로 달릴 수 있도록 한다. 용출의 경우, 1.5 개의 어금니 트리스-HCL의 100 마이크로 리터를 각각 20 개의 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 컬럼에서 고무 플러그를 제거하십시오.
0.1 의 어금니 글리신을 컬럼의 상부 챔버로 옮기고, 제조된 1.5 밀리리터 튜브 중 하나에 용액을 함유하는 항체를 수집하고 각 튜브에 대해 반복한다. 모든 항체가 수집되고 항체 함유 용출이 풀링되면 적절한 투석 튜브 클로빙으로 20센티미터 길이투석 튜브의 바닥을 닫고 항체 용출을 튜브로 조심스럽게 피펫합니다. 투석 튜브의 상단을 두 번째 클램프로 닫고 투석 튜브의 상부 클램프를 부동 스탠드에 고정합니다.
PBS의 비커에 마그네틱 스터드 바를 추가하고 비커를 자기 교반기 위에 놓습니다. 섭씨 4도에서 야간 투석 후, 10킬로달톤의 분자량 차단으로 원심 농축기로 완전한 투석기를 적재할 수 있도록 한 클램프를 열고, 농축기를 693회 G와 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 스핀의 끝에서, 항체 용액의 최종 1~1.5 밀리리터 부피가 얻어지날 때까지 두 번째 원심분리를 위해 PBS의 10 밀리리터를 가진 원심 농축기를 적재한다.
OVA를 안티 DEC-205 항체에 결합하려면 OVA 단백질 500 마이크로그램, 갓 준비된 TCEP-HCL 용액 240마이크로리터, 멸균 초순수 560마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 1.5밀리리터 튜브에 첨가하여 실내 온도에서 1.5시간 동안 사용할 수 있습니다. 동시에 PBS 900 마이크로리터에 2.5밀리그램의 안티 DEC-205와 갓 준비된 설포-SMCC 100마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 넣고 분당 550회전에서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양할 수 있습니다. 인큐베이션의 끝에서, 탈염 컬럼을 느슨하게 한 캡으로 놓고 바닥을 꼬인 개별 15 밀리리터 원모 튜브로 놓고 컬럼을 원심분리하여 액체를 제거합니다.
원심분리 후, 캡을 제거한 채 새로운 튜브에 컬럼을 배치하고, 항체 설포-SMCC 및 OVA TCEP-HCL 용액당 하나의 컬럼의 소형 수지 베드의 중심에 천천히 적재한다. 원심 분리 후 컬럼을 폐기하고 항체및 OVA 용액을 부드러운 파이펫팅과 즉시 혼합합니다. 반 DEC-205/OVA 용액을 원심 단백질 농축기에 적재하고 PBS로 농축기를 15 밀리리터 부피로 채웁니다.
2, 000배 G 및 실온에서 5분 동안 농축기를 원심분리하고 PBS의 10밀리리터를 추가로 농축기를 채웁니다. 동일한 원심분리기 조건하에서 적어도 8분 동안 농도를 원심분리한 후, 상부 챔버에서 농축된 샘플을 부드럽게 수집한다. 서양 블롯 분석에 의한 컨쥬게이션의 성공을 확인하기 위해 각 샘플의 알리쿼트를 단백질 표준에 SDS 젤에 적재하고 표준 SDS-PAGE 분석 프로토콜에 따라 겔을 실행합니다.
젤 블로팅 후, 표준 프로토콜에 따라 반 DEC-205 또는 OVA를 검출하기 위해 고추냉이 과산화증을 결합한 항체로 막을 얼룩지게 한다. 막은 각 샘플에서 각각의 단백질의 존재를 위해 분석될 수 있다. ELISA의 결합의 성공을 확인하기 위해, 적절한 96-웰 ELISA 플레이트를 잘 당 안티 OVA 항체의 100 마이크로리터로 코팅하고 1 대 2 비율로 안티 DEC-205 / OVA를 연속적으로 희석하고 블로킹 버퍼는 밀리리터 당 6 마이크로 그램에서 93.8 나노 그램으로 희석을 얻을 수 있습니다.
실온에서 1시간 배양하기 위해 항체 코팅 플레이트의 적절한 웰에 각 희석제 100마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 실온에서 1시간 배양을 위해 접시에 반DEC-205/OVA 공자에 대해 고추냉이 과산화제 공자 100마이크로리터를 첨가한 다음, 각 기수과 구산염기기의 50 마이크로리터를 추가하여 색소분석에 의한 색반응의 분석을 허용한다. 병렬 웨스턴 블롯 분석은 공주 된 OVA뿐만 아니라 공주 된 반 DEC-205를 모두 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
OVA에 대한 염색은 존재하는 경우 과도한 무료 OVA의 검출을 허용하고, 안티 DEC-205에 대한 염색은 벌거 벗은 안티 DEC-205 및 공주 사이의 분자량의 증가를 통해 결합의 성공을 검증한다. ELISA는 또한 검출된 신호와 분석된 단백질의 양 사이의 양립과의 결합을 통해 결합의 성공을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 이는 항 DEC-205/OVA 연상의 성공적인 생성을 나타낸다. 유동 세포질 및 면역형광 분석은 항 DEC-205 코어가 골수 유래 CD11c 양성 세포를 효율적으로 결합한다는 것을 명확하게 보여줍니다.
보조와 함께 항 DEC-205/OVA를 접종하면 OVA 및 보조인과 의한 예방 접종에 비해 마우스 수신자의 OVA 별 IgG 티터의 증가를 유도합니다. 더욱이, 안티-DEC-205/OVA는 반DEC-205/OVA 유도 CD8 양성 T 세포 반응을 통해 과도하게 특이적인 CD4 및 CD8 양성 T 세포 반응을 효과적으로 유도하여 OVA단독으로 유도한 반응을 현저히 초과한다. 항DEC-205 항체에 OVA 항원의 성공적인 유도를 위해, 입증된 바와 같이 물질을 준비하고 일관된 조건하에서 유도 단계를 수행하는 것이 중요하다.
항원 및 항체의 성공적인 컨쥬션에 이어, 생체 내에서 병원체 또는 종양 관련 면역의 결합 분석 및 유도를 포함한 수많은 후속 접근법이 가능하다.
