שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות במדויק ובקלות את הביטוי של חלבוני היעד בלב דג הזברה. השינוי בחלבון היעד מזוהה ישירות על ידי מדידת אימונופלואורסצנטיות. בצע איסוף וטיפול בעוברי דגי זברה, כמתואר בכתב היד של הטקסט.
ב 72 שעות לאחר ההפריה, להעביר את העוברים שקופיות זכוכית, ולצפות בהם תחת מיקרוסקופ סטריאו. הקלט מומים בלב, כגון בצורת קרום הלב, לולאה שונה וירידה בגודל. חשב שיעורי מום וניתח הבדלים בין קבוצות באמצעות ANOVA בכיוון אחד, ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה.
לאחר להרדים את העוברים עם 0.6 מיליגרם למיליליטר MS222, להקליט פעימות לב במשך 30 שניות, ולכומת את קצב הלב באמצעות תוכנת Image J. בזהירות לנתח לבבות מעוברי דג זברה עם מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על מגלשת זכוכית נקייה.
הוסף 50 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde ל 1.25 microliters של PBS כדי להפוך פתרון קבוע, ולאחר מכן למקם שלושה לבבות ניתחו לתוך מעגל מחסום הידרופובי אחד, ודגרה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. דקת הפתרון מתחת למיקרוסקופ ולייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפחות. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST במשך חמש דקות לכביסה.
הוסף 50 מיקרוליטרים של BSA ל- 1, 000 מיקרוליטרים של PBST כדי להשיג פתרון 5%BSA, ודגר את השקופיות בתא לח למשך שעה אחת כדי לחסום כריכת נוגדנים לא ספציפית. פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לדלל שני microliters של נוגדן חד שבטי עכבר נגד 8-hydroxydeoxygugusine ושני microliters של נוגדן פוליקלונלי ארנב נגד גמא-H2AX ב 296 microliters של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים ראשוני עובד.
לדגור על דגימות הלב עם 50 מיקרוליטרים של פתרון קוקטייל הנוגדנים העיקרי בתא לח לפחות שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. הדק את הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. לדלל microliter אחד של נוגדן משני נגד עכבר עיזים תווית FITC ומיקרוליטר אחד של psy-3 עיזים נגד ארנב נוגדן משני ב 500 microliters של PBST כדי לקבל פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד.
לדגור על הדגימות עם הנוגדנים המשניים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. הוסף 20 מיקרוליטרים של DAPI לדגימות להכתמה גרעינית, ודגר אותם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
החל פתק כיסוי על השקופית ולאטום אותו עם לק כדי למנוע ייבוש ותנועה. צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמת את האות הפלואורסצנטי של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים באמצעות הממוצע של דגימות בקרת DMSO וקבע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים.
עוברים שנחשפו PM 2.5 בהיעדר או נוכחות של נוגד חמצון, N-אצטיל-L-ציסטאין, או NAC, הוערכו לנוכחות של מומים בלב. EOM מ PM 2.5 עלה עלייה משמעותית טרטוגנזה לב, כגון בצקת קרום הלב, לולאה שונה וירידה בגודל, לעומת לבבות מטופלים בקרת DMSO. קצב הלב גם ירד באופן משמעותי בעוברים שנחשפו ל- EOM.
תוספת של NAC נכה מומים בלב הנגרמים על ידי EOM. בדיקת אימונופלואורסצנטיות שימשה להערכת היקף הנזק לדנ"א ברקמות שטופלו ב- EOM. רמות 8-הידרוקסידוקסיגואנוסין וביטוי גמא-H2AX עלו באופן משמעותי בליבם של עוברים דגי זברה שטופלו ב- EOM, מה שמצביע על עלייה בנזק לדנ"א חמצוני ושברים כפולים של DNA, בהתאמה.
נזק ה-DNA שנגרם על ידי EOM היה מנוגד חלקית על ידי תוספי NAC. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש להקפיד בעת שטיפת הדגימות עם PBS, כי הלב דג זברה עשוי לקלף את השקופית.
