פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והשימוש בעוברי עוף בין היום החמישי לשמונה של הדגירה לצורך הדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות ומחקרי אספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות שלוש השיטות להוצאת התוכן מקליפת הביצה ביום החמישי עד שמונה מאפשרות את התפתחותה בתוך הקליפה ודורשות רק כלי מעבדה בסיסיים. מודל זה מתאים לחקור היבטים שונים של מחקר אולטרסאונד וכלי דם כמו הדמיית זרימת דם, אספקת תרופות, וחומרי ניגוד ומתמרים חדשים של אולטרסאונד. כדי להכין עובר בן חמישה ימים, הניחו ביצית מופרית מודגרת בת חמישה ימים לתוך מחזיקת ביצה מחוממת מראש כאשר הביצית באותו כיוון כמו בתוך האינקובטור והשתמשו בקצה האחורי המחודד של קצה פינצטה כדי לבצע כניסה קטנה בחלק העליון של הביצית.
השתמשו בפינצטה כדי לבצע כניסה שנייה בצד הביצה בערך 2/3 לאורך הביצה והשתמשו בזוג פינצטות גדולות יותר כדי להסיר חתיכה קטנה של קליפת ביצה מהאזור המוסט בחלק העליון של הביצה, תוך הקפדה על כך ששק האוויר יוצר מגע עם אוויר הסביבה מבלי לחדור עמוק מדי. באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט 19 מדים חודרים את הקליפה דרך הכניסה השנייה כאשר המחט מכוונת כלפי מטה ומושכים כשני מיליליטר של אלבומין. כאשר האלבומין נאסף, השתמש בנייר דבק כדי לאטום את הנקב ולחלק את האלבומין לסירת שקילה.
השתמשו בפינצטה הגדולה כדי להגדיל את הפתח הקטן בחלק העליון של הביצית עד שהעובר והממברנה הכוריאלנטואית נראים במלואם מבלי להסיר את הקליפה מתחת לקרום הכוריו-אלנטואי או לחדור לממברנה הפנימית. כאשר נוצר פתח מספיק, סובבו את הביצה 180 מעלות בתוך המחזיק כך שהפתח בחלק העליון של הביצה פונה כעת לכיוון התחתון. לאחר דקה עד שתי דקות, העובר יצוף למעלה, ויהפוך לבלתי נראה מלמטה.
כאשר כל העובר והקרום הכוריואלנטואי נעלמו מהעין ורק החלמון גלוי, הסירו את הקלטת מהפתח הצדדי. החלק הפנימי של הביצה צריך לבלוט מתוך הפתח. תוך כדי החזקת תחתית הביצה קרוב לסירת השקילה במחזיק סירת המשקל המתכתית, השתמשו בנקודות החדות של הפינצטה הקטנה כדי לבצע שריטה אופקית בעדינות אך במהירות בקרום על פני כל רוחב הפתח ושחררו בעדינות את תוכן הביצה לתוך סירת השקילה.
בדוק אם פעימות הלב עדיין קיימות כדי לאשר שהעובר עדיין חי, כלי הממברנה הכוריואלנטואיים שלמים, ואין דליפת דם או חלמון. מניחים את העובר בר קיימא ב 37 מעלות צלזיוס עם מתן קבוע של טיפות 30 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS לעובר ולקרום chorioallantoic. כדי לקצור עובר בן שישה עד שבעה ימים וקרום כוריואלנטואי, הכינו את הביצית כפי שהודגם עבור עובר בן חמישה ימים והשתמשו במזרק חדש של חמישה מיליליטר המצויד במחט של 19 מדים כדי לחדור את הקליפה דרך הכניסה השנייה כאשר המחט מכוונת כלפי מטה כדי למשוך חמישה עד שישה מיליליטר של אלבומין בחדירה אחת.
כאשר האלבומין נאסף, הכנס את המחט של מזרק 10 מיליליטר המכיל בערך מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס PBS, יותר מהנפח הנסוג, לתוך הצד של הקליפה כאשר המחט מצביעה כלפי מטה כדי להחליף את האלבומין שנקטף. לאחר מכן, אטמו במהירות את הפער עם חתיכת סרט וסיימו לעבד את הביצה כפי שהודגם. כדי לקצור את העובר ואת הקרום הכוריאלנטואי מביצית מופרית בת שמונה ימים, החזיקו את הביצית אופקית, השתמשו בקצה האחורי של זוג פינצטות גדולות, ובצעו כניסה קטנה בערך באמצע הדרך לאורך הביצית.
ביצוע כניסות קטנות בתבנית טבעת 360 מעלות סביב חלל קליפת הביצה במרחק של כ-10 מילימטרים זה מזה. כאשר כל הכניסות נוצרו, השתמשו בקצה המחודד של הפינצטה כדי לפצח את הקליפה בין שתיים מהכניסות ולהטביע את הביצה לחלוטין ב-PBS של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בסוף הדגירה, הזיזו את הביצה מעל סירת שקילה ב-PBS והכניסו את שני האגודלים לתוך החור הגדול כדי לפתוח בעדינות את הביצה, שאמורה להיסדק לאורך הכניסות הקטנות.
כאשר הסדק נוצר סביב קליפת הביצה, משכו בעדינות את שני הצדדים זה מזה, תוך כדי הזזה עדינה של החלקים קדימה ואחורה עד שתכולת הביצה מופרדת מהקליפה ומשחררת את התוכן לתוך סירת המשקל. הרימו באיטיות את סירת המשקל המכילה את תכולת הביצים מה-PBS, תוך הטיה קלה של סירת הדרך כדי להסיר כל עודף PBS. לאחר מכן, הכניסו את סירת השקילה למחזיק סירת שקילה ממתכת.
בשלב זה ניתן לראות לב פועם בעובר. כדי להכין דגימת קרום עוברי וכוריואלנטואי להדמיית מיקרוסקופיה, הניחו מחזיק עם קרום אקוסטי עם אגרוז על תחתית צלחת פטרי של ליטר אחד המכילה כ-500 מיליליטר של PBS של 37 מעלות צלזיוס כאשר שכבת האגרוז פונה כלפי מעלה. השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך במהירות לתוך קרום vitellus בשישה עד שבעה חתכים סביב כל הממברנה chorioallantoic תוך סיבוב סירת השקילה לדיוק ומהירות טובים יותר.
השתמשו בכף כדי ללפף את קרום החיתוך המכיל את הממברנה העוברית ואת הממברנה הכוריאלנטואית והרימו באיטיות את הכפית כדי לאפשר בדיקה ויזואלית אם הממברנה החתוכה המכילה את הממברנה העוברית והכוריואלנטואית עדיין מחוברת לשארית קרום שק החלמון. הטה מעט את הכף כדי להיפטר מכמה שיותר חלמונים מבלי לייבש את הרקמה ולהטביע את הממברנה החתוכה ב- PBS בצלחת פטרי של ליטר אחד. באמצעות פינצטה קטנה, תפסו וסובבו בעדינות קצה אחד של הממברנה כדי להסיר כל חלמון שעדיין מחובר לפני הזזת הממברנה מעל המחזיק עם הממברנה האקוסטית.
השתמש בסיכת דגימת חרקים כדי להדק את הממברנה לפינות מנוגדות של המחזיק והימנע מפירסינג בכלי הממברנה הכוריואלנטואית. לאחר ששתי הפינות אובטחו, הרימו והטו מעט את המחזיק כדי להשליך את רוב ה-PBS והשתמשו בפינצטה הקטנה כדי למתוח ולפזר באופן שווה את הממברנה על המחזיק כדי לאפשר לשאר הממברנה להיות מוצמדת שטוחה למחזיק. לאחר אבטחת העובר, הכניסו את המחזיק למערך מיקרוסקופיה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והניחו קרום שקוף מבחינה אקוסטית ואופטית מעל אזור העניין בדגימה כדי לאפשר הדמיה אופטית של כלי הדם.
בניתוח מייצג זה הוסרו עוברים וקרומים כוריו-אלנטואיים בני חמישה, שישה, שבעה ושמונה ימים, כפי שהוכח. לא ניתן לראות דימום או נזק לעוברים או לממברנות chorioallantoic, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לקצור בבטחה את תוכן הביצית מבלי לפגוע בעובר או בכלי הממברנה chorioallantoic. סיבוכים מרובים יכולים להתרחש במהלך החילוץ, ולכן חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול בזהירות ולהשליך דגימות רקמה פגומה.
כפי שהוכח, העובר יכול להיות מוזרק עם, למשל, סוכני ניגוד אולטרסאונד כגון microbubbles. עם הלידה, ניתן לראות את בועות המיקרו מסתובבות בתוך לומן של כלי הדם המוזרק ומסתובבות בתוך הדם ההיקפי במשך מספר שעות. לפני הזרקת microbubble, ניתן כבר לראות ניגודיות בתוך הלב העוברי על ידי מצב B, אך לא הדמיה תת-הרמונית של אולטרסאונד בתדר גבוה.
תוספת של microbubbles מגביר את הניגודיות ואת הנראות של העובר בשני סוגי התמונות. תמונות תת-הרמוניות תלת-ממדיות בתדר גבוה יכולות להתקבל גם לאחר הזרקת חומר ניגוד כדי לדמיין רשתות כלי דם בתוך הממברנה העוברית והכוריואלנטואית. עוברי העוף וכלי הממברנה הכוריואלנטואית יכולים לשמש גם כדי לחקור אספקת תרופות בתיווך אולטרסאונד.
כאשר מנסים הליך זה, חשוב ביותר תמיד לשמור על העובר CAM ב 37 מעלות צלזיוס ולא לתת לו להתייבש. לאחר הליך זה, ניתן למקם את עובר העוף בתצורות שונות, כגון מיכל מים או מיקרוסקופ כדי לבצע הדמיית אולטרסאונד משופרת בניגוד או מחקרי אספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות. שיטה והכנה זו מתאימה למחקרי חומרי ניגוד באולטרסאונד ויכולה לשמש גם לחקר סרטן ונגיף.
