היי, קוראים לי גורפרט. המעבדה שלנו חוקרת מנגנונים של דלקת ריאות ותיקון. היי, שמי ג'סיקה ואני חוקרים חולדת מעבדה הנגרמת על ידי אוזון באלבולי באמצעות שיטות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות.
שלום לכולם, קוראים לי מנטרה. ואני חוקר דלקת ריאות בשיטות הדמיה של בעלי חיים. ריאות מתמודדות ללא הרף עם עלבונות ישירים ועקיפים, הנובעים סטרילי, כגון אוזון, ורכיבים מיקרוביאליים, כגון lipopolysaccharide חיידקי או LPS.
תגובה מארחת מוחצת עלולה לגרום לנשימה נפגעת ופגיעה חריפה בריאות המאופיינת בגיוס נויטרופילים לריאות, עקב חיסון מארח לא מוסדר, קרישה ושיפוץ רקמות. אנו מתארים ניתוח מקיף של תאים שונים, כלומר נוזל שטיפת ברונכו-מכתש, כלומר BAL, כלי הדם בריאה perfusate, כלומר LVP, קטעי קריו ריאות שמאל, דם היקפי ומח העצם ועצם הירך. לחשיפות לאוזון, הניחו בעדינות עכברים בתיבת האינדוקציה המותאמת אישית וחשפו את העכברים ללא הרף ל-0.05 עמודים לדקה של אוזון למשך שעתיים.
לחשיפות LPS, הרדמה את העכברים תחת קטמין תוך-פיוריטונלי קל ותערובת קסילאזין. עכשיו להחדיר 50 microliters את הפתרון LPS לתוך nares החיצוני עכברים. להחדיר עכברי בקרה עם 50 מיקרוליטרים של מלוחים סטריליים.
בנקודות זמן שצוינו, הרדמה את העכברים עם המינון המלא של קטמין ותערובת xylazine. לאחר מכן לחטא את העכברים ולבדוק רפלקסים הדוושה, כלומר לצבוט אחת מספרות הגפיים האחוריות, ולבחון נסיגה של האיבר. שום רפלקס לא אומר הרדמה עמוקה.
עכשיו לעשות חתך מתחת לעצם החזה ולחשוף את הלב. מניחים מחט 25 מד מחובר מזרק הפריניזציה לתוך החדר הימני ולמשוך דם על ידי ניקוב לב. לאסוף את הדם במזרקים heparinized ולנקז בצינורות microfuge לעיבוד נוסף.
יש להשתמש בזהירות בפינצטה או במלקחיים קהים כדי לפנות את אזור קנה הנשימה מרקמה מוגזמת. עכשיו תחתוך דרך כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות. מעבירים קשירה מכותנה מתחת לקנה הנשימה, ומשאירים אותה כך לעת עתה.
לצלוח את קנה הנשימה, במרווחים של כשליש מאורכו מן הריאות לקנה הנשימה. הכנס קנולה פוליאתילן 28 מד לתוך קנה הנשימה. לקשור בחוזקה את קשירה כותנה להחזיק את הצינורית במקום.
תוודא שלא תמוטט את הצינורית. עכשיו בהדרגה להזריק 0.5 מ"ל של PBS לתוך הצינורית בעזרת מזרק mL אחד. לאחר הזרקת PBS לשאוף את המזרק כל עוד זה לא להתנגד היניקה.
לאסוף את הנוזל שאפתן בצינור microphage שכותרתו, ולחזור על הליך זה פעמיים נוספות. חותכים את העורקים החזיים היורדים במיקום שבין חצאי בית החזה והבטן כדי למנוע גיבוי במהלך זלוף ריאות. כתם את החלל ליד קצה אב העורקים לחתוך ללא דם.
הבא לחלחל הריאות עם 0.5 מיליליטר של תמיסת מלח heparinized טמפרטורת החדר, להזריק אותו דרך החדר הימני. לאסוף את כלי הדם לחלחל מן החלל בקצה החתך של אב העורקים יורד. לאחר קשירת הסימפונות הימנית, תן לריאה השמאלית לנפח עם 0.5 מיליליטר של paraformaldehyde במשך חמש דקות.
עכשיו לחטא את חלק הבטן. חותכים את חלק הבטן ואת deskin אותו מעצם האגן. לאסוף את עצם האגן ולבודד את עצמות עצם הירך השמאלית והימנית בצלחת פטרי מלא מלוחים כל הזמן על קרח.
לאסוף את כלוב צלעות הגחון ועצם החזה לתוך צלחת פטרי מלא מלוחים, אשר נשמר גם על קרח. לחלחל את הקצוות החתוכים של העצמות עם ארבע פעמים עם 0.5 מיליליטר של מלוחים באמצעות מחטים מצויד היטב על 1 מזרקים ML. לאסוף את השברים מכל עצם לתוך צינורות פלקון שכותרתו, מצויד במסננים והניח על קרח.
צנטריפוגה כל הדגימות במשך 10 דקות ב 3000 סל"ד. לאסוף את supernatants פלאש להקפיא אותם. לשקם את התאים במינימום של 200 מיקרוליטרים של PBS.
בצע ספירות לויקוציטים כוללות. הכתים נוזל נוסף של BAL עם תערובת של ירוק קלצ'ין ואתידיום הומודימר אדום כתם אחד. לנתח את supernatant עבור כימוקינים וריכוז החלבון הכולל.
צנטריפוגה התאים להכין שני ציטוספין על כל שקופית וכתם עבור חלבונים ביוכימיים ומערכת החיסון. בצע כתמי H ו- E ששונו על קריוסקציות ריאות לכל הקבוצות. חלוקה ידנית לרמות של 150 עד 200 תאים בחלונית התמונה הממוזגת.
העתק את אזורי העניין המתוארים לכל הערוצים. מדדו את הפרמטרים המוגדרים מראש לכל הערוצים. חלק את עוצמת הפלואורסצנט של המולקולה המוכתמת על-ידי זו של DAPI או CD61.
אלה נקראים יחסי עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלים של DAPI או CD 61. הבא להתוות את הפרמטרים כדי להעריך את כל השינויים לאחר החשיפה. אמנם, חשיפות משולבות לא לגרום לשינויים בספירת תאי מח העצם BAL, LVP או עצם החזה הכולל, העכברים הציגו לויקוציטוזיס מערכתי ב 24 שעות, אשר ואחריו לויקופניה ב 72 שעות לאחר החשיפה.
אלה מוצגים בספירת תאי הדם ההיקפיים. ספירת תאי מח העצם בעצם הירך מראה את העלייה המאוחרת ב-72 שעות בהשוואה לכל נקודות הזמן. אנא שימו לב להיעדרם של כתמי סיגלק-F ו-CX3CRI בתאי פולימורפונוקלאריים בשעה 24 שעות בתמונה של ציטוספין BAL.
CYTOSpins BAL ו- LVP הראו נוכחות של תאים חד-גרעיניים CD11b ו- GR1 חיוביים באפס שעות. תאים פולימורפוניקלאריים המוצגים כסוג תא דומיננטי בכל התאים לאחר החשיפה. תכולת החלבון הכוללת של BAL הייתה הגבוהה ביותר ב-36 שעות לאחר החשיפה המשולבת.
עם זאת, חלבון LVP לא השתנה לאחר החשיפה. רמות האאוטקסין-2 והאינטרלוקין-2 היו הגבוהות ביותר בארבע השעות ב-LVP. כימוקינים אלה הופחתו בשבר BAL.
באופן מעניין, הנויטרופילים המדאיגים IL-16 וכימוקינים מולדים רבים שונו ב- LVP, אך לא בשבר BAL. בבסיס יותר מ 95% של תאי BAL היו מונו גרעיני מראה אקטין קליפת המוח, lamellipodia, מתח סיבי טובולין, והם היו חיוביים מאוד עבור כתמים mitotracker מופחת. בארבע שעות, הבחנו בתאי BAL עגולים, שאיבדו אקטין, אך הראו רשת microtubule פרושה כפי שמוצג בכתם מיטוטרקר מופחת אדום ונמוך יותר.
מוקדם לאחר החשיפה המשולבת, תאי BAL הופיעו חיובי כפול עבור calcein ואתידיום homodimer-1, אשר מציין תאים בסכנה חלקית. ב 36 שעות, תאי BAL היו קיימא במידה רבה, כלומר ירוק. ראינו כתמי ATP אלפא ו-Ly6G נפרדים במקרופאגים מכתשים BAL, ונויטרופילים.
ראינו ירידה ב-DAPI מנורמל ATP אלפא ועלייה בתכולת חלבון Ly6G תאית. החשיפות המשולבות המושרות ביטויים חולפים של Bal, תא רוצח טבעי K1.1, ATP נויטרופילים, תת יחידה PETA, גורם התפשטות, Ki-67 וביטויים מתמשכים של GR1 נויטרופילים, טסיות CX3CRI וחלבון אנגיוסטין אנטי אנגיוגני בתאי BAL לאחר החשיפה. למרות נזקי מחיצה ברונכיולר מכתשי היה צפוי, זה היה מפתיע לראות אגרגטים הסלולר בכלי גדול יותר ב 36 שעות לאחר החשיפה.
לבסוף, יש לנו תוצאות מסכמות בטבלה זו. אנו מקווים כי מודל המורין שלנו משמש אב טיפוס נגיש בקלות שניתן לשחזר במעבדות בלימה ברמה 2 לחקר המנגנונים של מוות תאי פולשני וזיהומים. תודה.
