안녕하세요, 내 이름은 구르프리트입니다. 우리의 실험실은 폐 염증 및 수리의 메커니즘을 조사합니다. 안녕하세요, 내 이름은 제시카이고 나는 형광 현미경 방법을 사용하여 오존 유도 실험실 쥐 폐포를 조사합니다.
안녕하세요 여러분, 내 이름은 Manpreet입니다. 그리고 동물 화상 진찰 방법으로 폐 염증을 연구합니다. 폐는 지속적으로 오존과 같은 멸균및 세균성 리포폴리사카라이드 또는 LPS와 같은 미생물 성분에서 발생하는 직접및 간접적인 모욕에 직면해 있습니다.
압도적인 호스트 반응은 통제되지 않는 호스트 면역, 응고성 및 조직 리모델링 때문에 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상한 호흡 및 급성 폐 상해귀착될 수 있습니다. 우리는 다양한 구획, 즉 기관지-폐포라 라베이지 액, 즉 BAL, 폐 혈관 난투, 즉 LVP, 좌측 폐 저온 섹션, 말초 혈액 및 흉골 및 대퇴골 골수의 포괄적인 분석을 설명합니다. 오존 노출의 경우 마우스를 사용자 지정 유도 상자에 부드럽게 배치하고 마우스를 오존0.05 PPM에 지속적으로 노출시2시간 동안 노출시다.
LPS 노출의 경우, 가벼운 인트라테오네케타민과 자일라진 믹스 하에서 마우스를 마취한다. 이제 LPS 용액50마이크로리터를 마우스 외부 나레에 주입합니다. 멸균 식염수 50 마이크로 리터와 제어 마우스를 주입.
지정된 시점에서 케타민과 자일라진 믹스의 전체 용량으로 마우스를 마취시화합니다. 다음으로 마우스를 살균하고 페달 반사 신경을 확인, 즉 뒷다리 숫자 중 하나를 꼬집고, 사지의 후퇴를 관찰. 반사작용이 없다는 것은 깊은 마취를 의미합니다.
이제 흉골 아래 컷을하고 마음을 노출. 혈액 주사기에 부착된 25게이지 바늘을 오른쪽 심실로 넣고 심장 펑크로 혈액을 그립니다. 고분리 된 주사기에서 혈액을 수집하고 추가 처리를 위해 미세 분리 튜브에서 배출하십시오.
조심스럽게 핀셋 이나 무딘 집게를 사용 하 여 오버티 티슈에서 기관 영역을 취소. 이제 폐를 노출하기 위해 흉곽을 잘라. 기관 아래에 면 합자를 전달하고 당분간 그대로 둡니다.
기관 절제술을 위해 폐에서 길이의 약 1/3에 간격을 두는 기관지. 기관지에 28 게이지 폴리에틸렌 캐뉼라를 삽입합니다. 면 합자를 단단히 묶어 캐뉼라를 제자리에 고정시합니다.
캐뉼라를 무너지지 않도록 하십시오. 이제 점차적으로 1 mL 주사기의 도움으로 캐뉼라에 PBS 0.5 ml를 주입합니다. PBS를 주입 한 후 흡입에 저항하지 않는 한 주사기를 흡인합니다.
표지된 미세 파기 튜브에서 흡인된 액체를 수집하고 이 절차를 두 번 더 반복합니다. 폐 관류 중 백업을 피하기 위해 흉부와 복부 반쪽 사이의 위치에서 내림차순 흉부 대자를 잘라. 절단 대오르타 끝 근처에 구멍을 얼룩 혈액이 없는 끝.
다음으로 폐에 0.5 ML의 상온 이산식염수를 주입하고 오른쪽 심실을 통해 주입합니다. 내림차순 흉부 대동맥의 절단 끝에 있는 구멍에서 혈관 분리를 수집합니다. 오른쪽 기관지계를 구각한 후, 왼쪽 폐가 0.5 ML의 파라포름알데히드로 팽창하여 5분간 팽창시키십시오.
이제 복부 부분을 소독합니다. 복부 부분을 잘라 골반 뼈에서 책상을 부수습니다. 골반 뼈를 수집하고 얼음위에 보관된 식염수 채워진 페트리 접시에 왼쪽과 오른쪽 대퇴골 뼈를 분리합니다.
복부 갈비뼈 케이지와 흉골을 식염수로 채워진 페트리 접시에 모아 얼음 위에 보관합니다. 잘 맞는 바늘을 1 ML 주사기에 사용하여 식염수0.5 ML로 뼈의 절단 끝을 4 번 퍼퓨즈하십시오. 각 뼈의 분획을 필터가 장착하고 얼음 위에 놓인 표지된 팔콘 튜브로 수집합니다.
심분리기는 3000 RPM에서 10분 동안 모든 샘플을 원심분리합니다. 초월체를 수집하고 플래시는 그들을 동결. PBS의 최소 200 마이크로 리터에서 세포를 재구성합니다.
총 백혈구 수를 수행합니다. 칼신 그린과 붉은 에디듐 호모디머 하나의 얼룩의 혼합으로 BAL의 또 다른 액체를 얼룩. 케모키인 및 총 단백질 농도에 대한 상체를 분석합니다.
원심 분리는 생화학 및 면역 단백질을 위한 각 슬라이드및 얼룩에 2개의 사이토스핀을 준비하는 세포를 준비합니다. 모든 그룹에 대해 폐 극저섹션에 수정된 H 및 E 염색을 수행합니다. 병합된 이미지 패널에서 150~200개의 셀을 수동으로 간략하게 설명합니다.
모든 채널에 관심 있는 영역을 복사합니다. 모든 채널에 대한 사전 설정 매개 변수를 측정합니다. 염색된 분자의 형광 강도를 DAPI 또는 CD61에 의해 나눕니다.
이들은 DAPI 또는 CD 61 정규화형 광등 강도 비율로 불려집니다. 다음으로 매개 변수를 플롯하여 노출 후 변경 내용을 평가합니다. 비록, 결합된 노출은 총 BAL, LVP 또는 흉골 골수 세포 수에 있는 어떤 변경도 유도하지 않았더라도, 마우스는 24 시간에 전신 백혈구증을 표시하고, 노출 후에 72 시간에 백혈구를 선행하였다.
이들은 말초 혈액 세포 수에 표시됩니다. 대퇴골골수 세포 수는 모든 시간 점에 비해 72 시간에 늦은 스파이크를 보여줍니다. BAL 사이토스핀의 이미지에서 24시간 동안 다형성 핵세포에 시글렉-F 및 CX3CRI 염색이 없는 점에 유의하시기 바랍니다.
BAL 및 LVP 사이토스핀은 0시간에 큰 CD11b 및 GR1 양성 단일핵 세포의 존재를 보여주었다. 다형성핵 세포는 노출 후 모든 구획에서 우세한 세포 유형으로 제시된다. BAL 총 단백질 함량은 결합 된 노출 후 36 시간으로 가장 높았습니다.
그러나, LVP 단백질은 노출 후에 변경되지 않았습니다. 에오타신-2 및 인터류신-2의 수준은 LVP에서 4시간 만에 가장 높았다. 이러한 케모키닌은 BAL 분획에서 감소되었다.
흥미롭게도, 호중구 경보 IL-16 및 많은 타고난 케모키네는 LVP에서 변경되었지만 BAL 분획은 아닙니다. BAL 세포의 95% 이상 기준선에서 피질 액틴, 라멜리포디아, 스트레스 및 튜룰린 섬유를 나타내는 모노 핵이 있었으며, 미토트래커 염색을 감소시키는 데 매우 긍정적이었습니다. 4시간 만에 액틴을 잃어버린 원형 BAL 세포를 관찰했지만, 적색 및 하부 감소된 미토트래커 염색에 도시된 바와 같이 마이크로튜블러 네트워크가 확산되는 것을 보여주었습니다.
결합 된 노출 후 초기, BAL 세포는 부분적으로 손상된 세포를 나타내는 칼세인과 에디듐 호모이머-1에 대한 이중 양성 등장. 36 시간에서 BAL 세포는 대체로 실행 가능했으며 녹색입니다. 우리는 BAL 폐포 대식세포 및 호중구에서 이산 ATP 알파 및 Ly6G 염색을 관찰했습니다.
우리는 DAPI 정상화 ATP 알파의 감소와 세포 내 Ly6G 단백질 함량의 증가를 관찰했다. 결합된 노출은 발, 천연 킬러 세포 및 K1.1, 호중구 ATP, 서브 유닛 PETA, 증식 인자, Ki-67 및 호중구 GR1, 혈소판 CX3CRI 및 발 세포에서 항 혈관신생 혈관발틴 단백질의 지속적인 발현을 유도하였다. 기관지 및 폐포 중격 손상이 예상되었지만 노출 후 36 시간 후에 대형 선박에서 세포 응고를 관찰하는 것은 놀랍습니다.
마지막으로 이 표에는 요약자 결과가 있습니다. 우리는 우리의 murine 모형이 침략적인 세포 죽음 및 감염의 기계장치를 공부하기 위한 레벨 2 봉쇄 실험실에서 재현될 수 있는 쉽게 접근할 수 있는 프로토타입역할을 하기를 바랍니다. 감사합니다.
