Hallo, mein Name ist Gurpreet. Unser Labor untersucht Mechanismen der Lungenentzündung und -reparatur. Hallo, mein Name ist Jessica und ich untersuche ozoninduzierte Labor-Rattenalveolen mit fluoreszierenden mikroskopischen Methoden.
Hallo zusammen, mein Name ist Manpreet. Und ich studiere Lungenentzündungen mit tierbildgebenden Methoden. Die Lunge ist ständig mit direkten und indirekten Beleidigungen konfrontiert, die durch sterile, wie Ozon, und mikrobielle Komponenten, wie das bakterielle Lipopolysaccharid oder LPS, entstehen.
Eine überwältigende Wirtsreaktion kann zu einer beeinträchtigten Atmung und einer akuten Lungenverletzung führen, die durch lungenneutrophile Rekrutierung gekennzeichnet ist, aufgrund einer unregulierten Immun-, Koagulans- und Gewebeumbauung des Wirts. Wir beschreiben eine umfassende Analyse verschiedener Kompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit, also BAL, des Lungengefäßperfusatsats, also LVP, linker Lungenschreibschnitte, peripherem Blut und dem Brust- und Femurknochenmark. Legen Sie die Mäuse bei Ozonexpositionen vorsichtig in die benutzerdefinierte Induktionsbox und setzen Sie die Mäuse zwei Stunden lang kontinuierlich 0,05 PPM Ozon aus.
Für LPS-Expositionen betäuben Sie die Mäuse unter leichtem intraperitonealem Ketamin und Xylazin-Mischung. Jetzt 50 Mikroliter aus der LPS-Lösung in die externen Nares der Mäuse einträufeln. Instillieren Sie Kontrollmäusen mit 50 Mikrolitern steriler Kochsalzlösung.
Anästhesieren Sie die Mäuse zu bestimmten Zeitpunkten mit der vollen Dosis Ketamin und Xylazin. Als nächstes desinfizieren Sie die Mäuse und überprüfen Sie auf Pedalreflexe, dh kneifen Sie eine der Hintergliedmaßenziffern, und achten Sie auf rückzug der Extremität. Kein Reflex bedeutet tiefe Betäubung.
Machen Sie nun einen Schnitt unter dem Brustbein und legen Sie das Herz frei. Legen Sie eine 25-Gauge-Nadel, die an einer heparinisierten Spritze befestigt ist, in den rechten Ventrikel und ziehen Sie Blut durch Herzpunktion. Sammeln Sie das Blut in heparinisierten Spritzen und lassen Sie es in Mikrofugenröhrchen zur weiteren Verarbeitung abtropfen.
Verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette oder eine stumpfe Pinzette, um die Trachealregion von darüber liegendem Gewebe zu befreien. Schneiden Sie nun durch den Brustkorb, um die Lunge freizulegen. Übergeben Sie eine Baumwollligatur unterhalb der Luftröhre und lassen Sie sie vorerst so.
Snip die Luftröhre, die etwa ein Drittel ihrer Länge von der Lunge entfernt ist, für die Tracheostomie. Führen Sie eine 28-Gauge-Polyethylenkanüle in die Luftröhre ein. Binden Sie die Baumwollligatur fest, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Kanüle nicht zusammenbrechen lassen. Nun mit Hilfe einer Spritze von einem ml schrittweise 0,5 ml PBS in die Kanüle injizieren. Nach der Injektion von PBS saugen Sie die Spritze aus, solange sie dem Absaugen nicht widersteht.
Sammeln Sie die angesaugte Flüssigkeit in einem markierten Mikrophagenröhrchen und wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male. Schneiden Sie die absteigende thorakale Aorta an der Stelle zwischen der Brust- und Bauchhälfte ab, um eine Sicherung während der Lungenperfusion zu vermeiden. Tupfen Sie die Höhle in der Nähe des geschnittenen Aortenendes frei von Blut.
Als nächstes durchtuchen Sie die Lunge mit 0,5 ML heparinisierter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur und injizieren Sie sie durch den rechten Ventrikel. Sammeln Sie das vaskuläre Perfusat aus der Höhle am geschnittenen Ende der absteigenden thorakalen Aorta. Nachdem Sie den rechten Bronchus ligiert haben, lassen Sie die linke Lunge fünf Minuten lang mit 0,5 ML Paraformaldehyd aufblasen.
Desinfizieren Sie nun den Bauchteil. Schneiden Sie den Bauchteil ab und entledigen Sie ihn aus dem Beckenknochen. Sammeln Sie den Beckenknochen und isolieren Sie die linken und rechten Oberschenkelknochen in einer mit Kochsalzlösung gefüllten Petrischale, die auf Eis gehalten wird.
Sammeln Sie den ventralen Brustkorb und das Brustbein in einer mit Kochsalzlösung gefüllten Petrischale, die ebenfalls auf Eis gehalten wird. Die geschnittenen Enden der Knochen viermal mit 0,5 ML Kochsalzlösung mit gut sitzenden Nadeln auf 1 ML Spritzen durchtreichen. Sammeln Sie die Fraktionen von jedem Knochen in markierten Falcon-Röhren, die mit Filtern ausgestattet und auf Eis gelegt werden.
Zentrifugieren Sie alle Proben für 10 Minuten bei 3000 U / min. Sammeln Sie die Überstände und frieren Sie sie blitzen ein. Rekonstituieren Sie die Zellen in mindestens 200 Mikroliter PBS.
Führen Sie eine Gesamtleukozytenzählung durch. Färben Sie eine weitere Flüssigkeit bal mit einer Mischung aus Calceingrün und dem roten Ethidiumhomdimer einen Fleck. Analysieren Sie den Überstand auf Chemokine und die Gesamtproteinkonzentration.
Zentrifugieren Sie die Zellen, um zwei Zytospins auf jedem Objektträger und Färbung für biochemische und Immunproteine vorzubereiten. Führen Sie eine modifizierte H- und E-Färbung auf Lungenschreiosektionen für alle Gruppen durch. Umreißen Sie manuell 150 bis 200 Zellen im zusammengeführten Bildfenster.
Kopieren Sie die skizzierten Regionen von Interesse auf alle Kanäle. Messen Sie die voreingestellten Parameter für alle Kanäle. Teilen Sie die Fluoreszenzintensität des gefärbten Moleküls durch die von DAPI oder CD61.
Diese werden als DAPI oder CD 61 normalisierte Fluoreszenzintensitätsverhältnisse bezeichnet. Als nächstes zeichnen Sie die Parameter auf, um alle Änderungen nach der Belichtung zu bewerten. Obwohl kombinierte Expositionen keine Veränderungen der Gesamtwerte der BAL-, LVP- oder Sternalknochenmarkzellen induzierten, zeigten die Mäuse nach 24 Stunden eine systemische Leukozytose, gefolgt von Leukopenie nach 72 Stunden nach der Exposition.
Diese werden in den peripheren Blutkörperchen angezeigt. Die Anzahl der Femurknochenmarkzellen zeigt den späten Spike nach 72 Stunden im Vergleich zu allen Zeitpunkten. Bitte beachten Sie das Fehlen einer Siglec-F- und CX3CRI-Färbung in polymorphonukleären Zellen nach 24 Stunden im Bild von BAL Cytospin.
BAL- und LVP-Zytospine zeigten große CD11b- und GR1-positive mononukleäre Zellen bei null Stunden. Polymorphonukleäre Zellen präsentierten sich nach der Exposition in allen Kompartimenten als vorherrschender Zelltyp. Der Bal-Gesamtproteingehalt war 36 Stunden nach kombinierter Exposition am höchsten.
Das LVP-Protein blieb jedoch nach der Exposition unverändert. Die Spiegel von Eotaxin-2 und Interleukin-2 waren in den vier Stunden in LVP am höchsten. Diese Chemokine wurden in der BAL-Fraktion reduziert.
Interessanterweise wurden das neutrophile alarmierende IL-16 und viele angeborene Chemokine im LVP verändert, aber nicht in der BAL-Fraktion. Zu Studienbeginn waren mehr als 95% der BAL-Zellen mononukleär und zeigten kortikales Aktin, Lamellipodie, Stress und Tubulinfasern, und sie waren stark positiv für eine reduzierte Mitotracker-Färbung. Nach vier Stunden beobachteten wir kreisförmige BAL-Zellen, die Aktin verloren hatten, aber ein ausgebreitetes Mikrotubuli-Netzwerk zeigten, wie es in roter und niedriger reduzierter Mitotracker-Färbung gezeigt wurde.
Früh nach der kombinierten Exposition erschienen BAL-Zellen doppelt positiv für Calcein und Ethidiumhomdimer-1, was auf teilweise kompromittierte Zellen hinweist. Nach 36 Stunden waren die BAL-Zellen weitgehend lebensfähig, das heißt grün. Wir beobachteten diskrete ATP-alpha- und Ly6G-Färbungen in BAL-Alveolar-Makrophagen und Neutrophilen.
Wir beobachteten eine Verringerung des DAPI-normalisierten ATP-alpha und einen Anstieg des intrazellulären Ly6G-Proteingehalts. Die kombinierten Expositionen induzierten transiente Expressionen von Bal, natürlicher Killerzelle und K1.1, neutrophilem ATP, Untereinheit PETA, Proliferationsfaktor, Ki-67 und anhaltenden Expressionen von Neutrophil GR1, Thrombozyten CX3CRI und dem antiangiogenen Angiostatinprotein in BAL-Zellen nach der Exposition. Obwohl bronchioläre und alveoläre Septumschäden erwartet wurden, war es überraschend, zelluläre Aggregate in größeren Gefäßen 36 Stunden nach der Exposition zu beobachten.
Schließlich haben wir zusammenfassende Ergebnisse in dieser Tabelle. Wir hoffen, dass unser mausines Modell als leicht zugänglicher Prototyp dient, der in Containment-Laboren der zweiten Ebene reproduziert werden kann, um die Mechanismen des invasiven Zelltods und der Infektionen zu untersuchen. Vielen Dank.
