Merhaba, benim adım Gurpreet. Laboratuvarımız akciğer iltihabı ve onarımı mekanizmalarını araştırır. Merhaba, benim adım Jessica ve floresan mikroskobik yöntemler kullanarak ozon kaynaklı laboratuvar faresi alveolleri araştırıyorum.
Herkese merhaba, benim adım Manpreet. Ve hayvan görüntüleme yöntemleriyle akciğer iltihabı üzerinde çalışıyorum. Akciğerler, ozon gibi steril ve bakteriyel lipopolisakkarit veya LPS gibi mikrobiyal bileşenlerden kaynaklanan doğrudan ve dolaylı hakaretlerle sürekli olarak karşı karşıyadır.
Ezici bir konak yanıtı, düzensiz konak immün, pıhtılaştırıcı ve doku tadilatı nedeniyle akciğer nötrofil alımı ile karakterize olarak solunum ve akut akciğer hasarına neden olabilir. Çeşitli bölmelerin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının, yani BAL'ın, akciğer vasküler perfüzyonun, yani LVP'nin, sol akciğer kriyo bölümlerinin, periferik kanın ve sternal ve femur kemik iliğinin kapsamlı bir analizini açıklıyoruz. Ozon maruziyetleri için, fareleri özel indüksiyon kutusuna hafifçe yerleştirin ve fareleri iki saat boyunca sürekli olarak 0,05 PPM ozona maruz kalın.
LPS maruziyetleri için, fareleri hafif intraperitoneal ketamin ve ksilazin karışımı altında uyuşturun. Şimdi LPS çözeltisine farelerin harici nares içine 50 mikrolitre aşıla. Kontrol farelerini 50 mikrolitre steril salin ile aşıla.
Belirtilen zaman noktalarında, fareleri tam doz ketamin ve ksilazin karışımı ile uyuşturun. Daha sonra fareleri sterilize edin ve pedal reflekslerini kontrol edin, yani arka uzuv basamaklarından birini kıstırın ve uzuvların geri çekilmesini gözlemleyin. Refleks olmaması derin anestezi demektir.
Şimdi göğüs kemiğinin altından bir kesik yap ve kalbi açığa çıkar. Heparinize şırıngaya bağlı 25 kalibrelik bir iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve kalp delinmesi ile kan alın. Heparinize şırıngalardaki kanı toplayın ve daha fazla işlem için mikroyakıt tüplerinde boşaltın.
Trakeal bölgeyi aşırı dokudan temizlemek için cımbız veya künt tokmakları dikkatlice kullanın. Şimdi akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Nefes borusunun altına pamuklu bir bağ geçirin ve şimdilik böyle bırakın.
Trakeostomi için akciğerlerden uzunluğunun yaklaşık üçte birinde aralıklı trakeayı kesin. Trakeaya 28 kalibrelik bir polietilen canül yerleştirin. Kanülü yerinde tutmak için pamuk bağını sıkıca bağlayın.
Canülü çökertmediğinizden emin olun. Şimdi yavaş yavaş bir mL şırınna yardımıyla 0,5 ml PBS'yi kanolaya enjekte edin. PBS enjekte ettikten sonra, emmeye direnmediği sürece şırınnayı epire edin.
Aspire sıvıyı etiketli bir mikrofaj tüpünde toplayın ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Akciğer perfüzyonu sırasında herhangi bir yedeklemeden kaçınmak için torasik ve karın yarıları arasındaki yerde azalan torasik aortu kesin. Kesilen aort ucunun yakınındaki boşluğu kansız olarak lekele.
Daha sonra akciğerleri 0,5 ML oda sıcaklığında heparinize salin ile perfuse, sağ ventrikülden enjekte edin. Vasküler perfüzyonu, alçalaşı torasik aortun kesik ucundaki boşluktan toplayın. Sağ bronşu lige ettikten sonra, sol akciğerin beş dakika boyunca 0,5 ML paraformaldehit ile şişmesine izin verin.
Şimdi karın kısmını sterilize edin. Karın kısmını kes ve pelvik kemikten ayır. Pelvik kemiği toplayın ve sol ve sağ uyluk kemiği kemiklerini buzda tutulan tuzlu su dolu bir petri kabında izole edin.
Ventral göğüs kafesini ve sternumu, aynı zamanda buzda tutulan tuzlu su dolu bir Petri kabına toplayın. Kemiklerin kesik uçlarını 1 ML şırınga üzerine iyi yerleştirilmiş iğneler kullanarak 0,5 ML tuzlu su ile dört kez perfuse edin. Kesirleri her kemikten etiketli Falcon tüplerine toplayın, filtrelerle donatılmış ve buza yerleştirin.
Tüm numuneleri 3000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantları toplayın ve flaş dondurun. Hücreleri en az 200 mikrolitre PBS'de yeniden inşa edin.
Toplam lökosit sayısını gerçekleştirin. Bal'ın başka bir sıvısını kalsein yeşili ve kırmızı ethidium homodimer bir leke karışımı ile lekelenin. Kemokinler ve toplam protein konsantrasyonu için süpernatant analiz edin.
Biyokimyasal ve immün proteinler için her slaytta iki sitospin ve leke hazırlamak için hücreleri santrifüjleyin. Tüm gruplar için akciğer kriyoseksiyonlarında değiştirilmiş H ve E boyama gerçekleştirin. Birleştirilmiş görüntü panelinde 150 ila 200 hücreyi el ile anahat olarak özetleyin.
Anahattılan ilgi alanlarını tüm kanallara kopyalayın. Tüm kanallar için önceden ayarlanmış parametreleri ölçün. Lekeli molekülün floresan yoğunluğunu DAPI veya CD61 ile bölün.
Bunlar DAPI veya CD 61 normalleştirilmiş floresan yoğunluk oranları olarak terimlendirilir. Daha sonra pozlamadan sonra değişiklikleri değerlendirmek için parametreleri çizin. Kombine maruziyetler toplam BAL, LVP veya sternal kemik iliği hücre sayılarında herhangi bir değişikliğe neden olmamasına rağmen, fareler 24 saatte sistemik lökositoz gösterdi ve bunu maruziyet sonrası 72 saatte lökopeni izledi.
Bunlar periferik kan hücresi sayımlarında görüntülenir. Uyluk kemiği iliği hücre sayıları, tüm zaman noktalarına kıyasla 72 saatte geç ani artış gösterir. Bal sitospin görüntüsünde 24 saatte polimorfonukleer hücrelerde Siglec-F ve CX3CRI lekelerinin olmamasına dikkat edin.
BAL ve LVP sitospinleri sıfır saatte büyük CD11b ve GR1 pozitif mononükleer hücrelerin varlığını gösterdi. Polimorfonuklear hücreler maruziyet sonrası tüm bölmelerde baskın hücre tipi olarak sunulmuştur. BAL toplam protein içeriği kombine maruziyet sonrası 36 saat ile en yüksek düzeydeydi.
Ancak maruziyet sonrası LVP proteini değişmedi. Eotaxin-2 ve interlökin-2 düzeyleri LVP'de dört saat içinde en yüksekti. Bu kemokinler BAL fraksiyonunda azaltıldı.
İlginçtir ki, nötrofil endişe verici IL-16 ve birçok doğuştan gelen kemokin LVP'de değiştirildi, ancak BAL fraksiyonunda değil. Bal hücrelerinin %95'inden fazlası kortikal aktin, lamellipodia, stres ve tübulin lifleri gösteren mono nükleerdi ve mitotracker lekelerinin azalması için güçlü bir şekilde pozitifti. Dört saat içinde, aksin kaybetmiş, ancak kırmızı ve daha düşük azaltılmış mitotracker lekelemesinde gösterildiği gibi yayılmış bir mikrotübül ağı gösteren dairesel BAL hücreleri gözlemledik.
Kombine maruziyetten erken sonra, BAL hücreleri kısmen tehlikeye giren hücreleri gösteren kalsenin ve etiyum homodimer-1 için çift pozitif göründü. 36 saatte BAL hücreleri büyük ölçüde uygulanabilirdi, bu yeşildi. BAL alveolar makrofajlarda ve nötrofillerde ayrık ATP alfa ve Ly6G lekelenmeleri gözlemledik.
DAPI normalleştirilmiş ATP alfasında azalma ve hücre içi Ly6G protein içeriğinde bir artış gözlemledik. Kombine maruziyetler Bal, doğal katil hücre ve K1.1, nötrofil ATP, alt birim PETA, çoğalma faktörü, Ki-67 ve maruziyet sonrası BAL hücrelerinde nötrofil GR1, trombosit CX3CRI ve anti-anjiyojenik anjiyostatin proteininin sürekli ekspresyonlarına neden oldu. Bronşiyolar ve alveolar septal hasar beklenmesine rağmen, maruziyetten 36 saat sonra daha büyük damarlarda hücresel agregaların gözlemlenerek gözlemlenerek tespit edildi.
Son olarak, bu tabloda özetleyici sonuçlarımız var. Murine modelimizin, invaziv hücre ölümü ve enfeksiyonlarının mekanizmalarını incelemek için ikinci seviye muhafaza laboratuvarlarında çoğaltılabilen kolayca erişilebilir bir prototip olarak hizmet ettiğini umuyoruz. Teşekkürler.
