הפרוטוקול הוא משמעותי שכן הוא מראה בידוד ו transfection של תאי אפיתל פיגמנט מחמישה יונקים כמערכת אופטימלית לחקר טיפול גנטי עינית בכיוונים שונים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הגמישות שלה, יכולת העברה, תפוקת תאים גבוהה, כדאיות ושיעור transfection בשל חמשת המינים ואת מערכת טרנספוסון SB100X לא ויראלי בשימוש. טכניקות אלה פותחו כדי לחקור גישות ריפוי גנטי המתמקדות בתאי אפיתל של פיגמנט רשתית ואיריס, אשר מבודדים ומודבקים בפרוטוקול הנוכחי, אך שמישים לכל מחקר עיני.
מדגים את ההליך יהיה גרג סילי, טכנאי מהמעבדה. לאחר המתת חסד החיה, להשתמש במספריים מעוקלים מלקחיים קוליברי כדי להכשיר את העיניים, ולאחר מכן לנקות את רקמת השריר הנותרת ואת העור מהעיניים. לאסוף את העיניים בצינור 50 מיליליטר מלא PBS לא סטרילי ולהעביר את הצינור למכסה המנוע זרימה למינאר.
לחטא אותם על ידי שקוע בתמיסה מבוססת יוד במשך שתי דקות, ולאחר מכן להעביר את העיניים לצינור 50 מיליליטר מלא PBS סטרילי. שים עין אחת על דחיסת גזה סטרילית והחזק בחוזקה את העין קרוב לעצב הראייה. ואז לחתוך ליד הגבול של הקשתית עם מספר 11 אזמל.
באמצעות מספריים, לחתוך סביב הקשתית ולהסיר את החלק החלק החלק העורפי ולשים אותו בצלחת פטרי, משאיר את הנורה עם הזגג עד אפיתל הפיגמנט ברשתית, או תאי RPE, מבודדים. כדי לבודד אפיתל פיגמנט קשתית, או תאי IPE, להסיר את העדשה עם מלקחיים עדינים בעדינות לשלוף את הקשתית המכילה את תאי IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי ושטפים אותה עם PBS סטרילי.
הוסף 500 מיקרוליטרים של 0.25%טריפסין ודגרה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את טריפסין, להוסיף 500 microliters של מדיום מלא, ולגרד את IPE בעדינות עם פיפטה פסטר שטוח, אש מלוטשת. לאסוף את ההשעיה התא ולשים אותו בצינור 1.5 מיליליטר.
לספור את התאים באמצעות תא Neubauer, ולזרוע 0.2 מיליון תאים לבאר בצלחת 24 היטב עם מיליליטר אחד של מדיום מלא. מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כדי לבודד תאי RPE, הסר את ההומור והרשתית הזגגיים מהקטע האחורי עם מלקחיים דקים.
שים את הנורות בצלחת 24 היטב ולהוסיף 500 microliters של 0.25%טריפסין לכל עין ודגרה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר טריפסין, הוסף 500 מיקרוליטרים של מדיום מלא לכל כדור ולגרד את תאי RPE בעדינות עם פיפטה פסטר מעוקל, מלוטש אש. לאסוף את ההשעיה התא ולשים אותו בצינור 1.5 מיליליטר.
לספור את התאים באמצעות תא Neubauer ולזרוע את התאים כמתואר קודם לכן. מניחים את הצלחת באינקובטור. יש לנקות את רקמת השריר והעור הנותרים מהעיניים ולחטא את העיניים בתמיסה מבוססת יוד ולשטוף אותן ב-PBS.
כדי לבודד תאי IPE, הסר את העדשה ומשוך את הקשתית כמתואר קודם לכן. לאחר הכנת שתי קשתיות, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום מלא ולבודד את התאים על ידי גירוד עם פסטר שטוח, אש מלוטשת pipette, ולאחר מכן לספור ולזרוע את התאים. מניחים את הצלחת באינקובטור.
כדי לבודד תאי RPE, להסיר את הזגג ואת הרשתית מן החלק האחורי ומניחים את הנורה בצלחת פטרי. מלא את הנורה עם מדיום מלא מיליליטר אחד. באמצעות פיפטת פסטר מעוקלת ומלוטשת, הסר את תאי ה- RPE.
לאסוף את מתלה התא בתוך הנורה באמצעות 1,000 pipette microliter, ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר עבור resuspension. לאחר מכן לספור ולזרוע את התאים ולדגירה את הצלחת כפי שהוכח בעבר. לאחר ניקוי, לפתוח את העין לחתוך סביב הקשתית כדי להסיר את החלק החלקי, ולאחר מכן לשים צלחת פטרי.
השאירו את הנורה עם הזכות עד שתאי RPE מבודדים. כדי לבודד תאי IPE, אם העדשה מגיעה עם המקטע החיצוני, הסר את העדשה והשתמש במלקחיים עדינים כדי לשלוף בעדינות את הקשתית המכילה את תאי IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי ושטפים אותה עם PBS סטרילי.
חותכים את גוף הססנים עם אזמל מספר 10. לאחר הכנת הקשתית, לדגור אותם עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את טריפסין ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום שלם, ולאחר מכן לבודד את התאים על ידי גירוד עם פיפטה פסטר שטוח, אש מלוטשת.
העבר את ההשעיה התא לתוך צינור שני מיליליטר וצנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 120 פעמים G.להשליך את supernatant ול resuspend התאים בשני מיליליטר של מדיום מלא. זרע 0.32 מיליון תאים לבאר בצלחת שש באר בשלושה מיליליטר של מדיום מלא. מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
כדי לבודד תאי RPE, הסר את ההומור והרשתית הזגגיים מהקטע האחורי עם מלקחיים. הימנע מפגיעה באפיתל הפיגמנט ברשתית. לשטוף את הנורה עם PBS.
לאחר הכנת שתי העיניים, למלא את הנורה כשלושה רבעים מלאים עם טריפסין, ודגור במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם מכסה צלחת פטרי על גבי עין הנורה. הסר את טריפסין ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום מלא. באמצעות פיפטת פסטר מעוקלת ומלוטשת, הסר את תאי ה- RPE.
לאסוף את השעיית התא בתוך הנורה ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר עבור resuspension. צנטריפוגות התאים במשך 10 דקות ב 120 פעמים G.Seed 0.32 מיליון תאים לבאר בצלחת שש באר בשלושה מיליליטר של מדיום מלא. מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
תרבית התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, pipette למעלה ולמטה כדי לאסוף תאים שאינם רהוטים ולשים מחצית הנפח בבאר אחרת. ממלאים את הבאר למיליליטר אחד במדיום מלא.
לאחר שלושה עד ארבעה ימים נוספים, חזור על אוסף התאים, והפעם צירוף התאים הלא-עקביים משתי בארות לאחת. מוסיפים בינוני לכל בארות. התבונן בתאים ושנה את המדיום פעמיים בשבוע.
כאשר תאים מגיעים למפגש, עבור למדיום מלא עם 1%FBS. באמצעות הפרוטוקולים הנ"ל, תאי IPE ו- RPE בודדו בהצלחה ותרביתו מחמישה מינים שונים. תבנית ביטוי RPE אושרה בתאי IPE ראשיים של בקר על-ידי אימונופלואורסצנטיות עבור RPE65.
הכדאיות של התא נחקרה כדי לא לכלול רעילות פוטנציאלית של מאגר אלקטרופורציה באמצעות ערכת בדיקת ציטוקסיה זמינה מסחרית ובקרה אלקטרופורציה קשר. לא נצפתה השפעה על הכדאיות של התא. תאי אפיתל פיגמנטים פרה-תרבותיים ממינים שונים הועברו לחלבון ונוס הפלואורסצנטי הצהוב.
תאי RPE19 שהודבקו שימשו כפקד חיובי. הכימות של יעילות transfection ב RPE חזיר מראש מוצג כאן. תאי אפיתל פיגמנט ארנב מבודד טרי הועברו לחלבון הפלואורסצנטי הצהוב ונוס ונוטרו על ידי מיקרוסקופיה.
תאי אפיתל פיגמנט היו transfected עם גורם נגזר אפיתל פיגמנט והפרשת חלבון היה במעקב על ידי כתם מערבי. האות לתאים שהודבקו היה גבוה יותר בהשוואה לתאים שאינם נגועים בכל המינים והימים שנחקרו, ולא נצפתה ירידה בהפרשת החלבון בתקופה זו. זה חיוני כדי למנוע גירוד התאים עם כלים חדים.
כאן, פיפטות פסטר מלוטשות אש משמשים, למעט בעיני עכבר קטנות, שם יש להשתמש באזמל עגול. תאי אפיתל פיגמנט יכול לשמש לפיתוח גישות ריפוי גנטי כדי לדמות תנאים פתולוגיים, למשל, נזק ללחץ חמצוני. מודלים אלה יכולים לשמש גם לבדיקת תרופות טיפוליות.
