Protokol, beş memeliden pigment epitel hücrelerinin izolasyonunu ve transfeksiyonunu çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisini incelemek için en uygun sistem olarak gösterdiğinden önemlidir. Bu yöntemin temel avantajı, beş tür ve kullanılan viral olmayan SB100X transposon sistemi nedeniyle esnekliği, aktarilebilirliği, yüksek hücre verimi, canlılığı ve transfeksiyon oranıdır. Bu teknikler, mevcut protokolde izole edilen ve transkre enfekte olan, ancak herhangi bir oküler araştırma için kullanılabilir olan retina ve iris pigment epitel hücrelerini hedefleyen gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için geliştirilmiştir.
Prosedürü gösteren gregg Sealy, laboratuvardan bir teknisyen. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, gözleri enükle etmek için kavisli makas ve Kolibri tokmakları kullanın, ardından kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin. Gözleri steril olmayan PBS ile dolu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın.
İki dakika boyunca iyot bazlı çözeltiye batırarak dezenfekte edin, ardından gözleri steril PBS ile dolu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir gözünü steril bir gazlı bez kompresine koyun ve gözü optik sinire sıkıca yakın tutun. Daha sonra 11 numaralı neşter ile iris sınırına yakın kesin.
Makas kullanarak, irisin etrafını kesin ve ön segmenti çıkarın ve bir Petri kabına koyun, retina pigment epitel veya RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın. İris pigment epitelini veya IPE hücrelerini izole etmek için lensi ince epektlerle çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çekin. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın.
% 0.25 tripsin 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın, 500 mikrolitre tam orta ekleyin ve IPE'yi düz, ateş cilalı bir Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun.
Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve bir mililitre tam orta ile 24 kuyu plakasında kuyu başına 0.2 milyon hücre tohumlayın. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin. RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı ince torpidolarla arka segmentten çıkarın.
Ampulleri 24 kuyu plakasına koyun ve göz başına% 0.25 trypsin 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın, dünya başına 500 mikrolitre tam orta ekleyin ve RPE hücrelerini kavisli, ateş cilalı bir Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun.
Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin. Kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin ve gözleri iyot bazlı çözeltide dezenfekte edin ve PBS ile durulayın.
IPE hücrelerini izole etmek için lensi çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi irisi çekin. İki iris hazırladıktan sonra, bir mililitre tam orta ekleyin ve düz, ateşle cilalanmış bir Pasteur pipetle çizerek hücreleri izole edin, ardından hücreleri sayın ve tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin.
RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus ve retinayı arka segmentten çıkarın ve ampulü bir Petri kabına yerleştirin. Ampulü bir mililitre komple orta ile doldurun. Kavisli, ateş cilalı pasteur pipet kullanarak RPE hücrelerini çıkarın.
Hücre süspansiyonunu 1.000 mikrolitre pipet kullanarak ampul içinde toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri sayın ve tohumlayın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi kuluçkaya yatırın. Temizledikten sonra, gözü açın ve ön segmenti çıkarmak için irisin etrafını kesin, ardından bir Petri kabına koyun.
RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın. IPE hücrelerini izole etmek için, lens ön segmentle birlikte geliyorsa, lensi çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çıkarmak için ince önps kullanın. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın.
Silier gövdeyi 10 numaralı neşterle kesin. İrisleri hazırladıktan sonra, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 0.25 trypsin iki mililitre ile kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve iki mililitre tam orta ekleyin, ardından düz, ateş cilalı bir Pasteur pipet ile çizerek hücreleri izole edin.
Hücre süspansiyonu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 120 kez 10 dakika boyunca santrifüjleyin G.Süpernatantı atın ve hücreleri iki mililitrelik tam ortamda yeniden biriktirin. Tohum 0.32 milyon hücre kuyu başına altı kuyu plakasında üç mililitre tam orta. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin.
RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı arka segmenttenps ile çıkarın. Retina pigment epitelinin zarar görmesinden kaçının. Ampulü PBS ile yıkayın.
Her iki gözü de hazırladıktan sonra, ampulü yaklaşık dörtte üçü trypsin ile doldurun ve ampul gözünün üstünde petri kabı kapağı ile 37 santigrat derecede 25 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve bir mililitre tam orta ekleyin. Kavisli, ateş cilalı pasteur pipet kullanarak RPE hücrelerini çıkarın.
Hücre süspansiyonunu ampul içinde toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 120 kez G.Seed 0.32 milyon hücrede üç mililitrelik tam ortamda altı kuyu plakasında santrifüjleyin. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin.
Hücreleri 37 santigrat derecede ve nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksitle kültürlendir. Üç ila dört gün sonra, doğal olmayan hücreleri toplamak için pipet yukarı ve aşağı ve hacmin yarısını başka bir kuyuya koyun. Kuyuyu tam orta ile bir mililitreye doldurun.
Üç ila dört gün sonra, hücre koleksiyonunu tekrarlayın, bu sefer doğal olmayan hücreleri iki kuyudan bire bir toplayın. Tüm kuyulara orta ekleyin. Hücreleri gözlemleyin ve ortamı haftada iki kez değiştirin.
Hücreler birleştiğinde,% 1 FBS ile komple ortama geçin. Yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak, IPE ve RPE hücreleri beş farklı türden başarıyla izole edildi ve kültürlendi. RPE ekspresyon deseni birincil sığır IPE hücrelerinde RPE65 için immünofluoresans ile doğrulandı.
Hücre canlılığı, piyasada bulunan bir sitotoksiklik test kiti ve düğüm elektroporlu kontrolü kullanılarak elektroporasyon tamponunun potansiyel toksisitesini dışlamak için çalışıldı. Hücre canlılığı üzerinde herhangi bir etki gözlenmedi. Farklı türlerden prekültüre pigment epitel hücreleri sarı floresan Venüs proteini ile transfekte edildi.
Transfected RPE19 hücreleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Önceden şekillendirilmiş domuz RPE'sinde transfeksiyon verimliliğinin nicelemesi burada gösterilmiştir. Yeni izole edilmiş tavşan pigment epitel hücreleri sarı floresan protein Venüs ile transkred edildi ve mikroskopi ile izlendi.
Pigment epitel hücreleri pigment epitel türevi faktör ile transkredasyon edildi ve protein salgısı Batı blot tarafından izlendi. Transfected hücreler için sinyal, çalışılan tüm türler ve günler için transkıpte olmayan hücrelere kıyasla daha yüksekti ve bu süre içinde protein salgısında bir azalma gözlenmedi. Hücreleri keskin aletlerle kazımaktan kaçınmak çok önemlidir.
Burada, yuvarlak bir neşter kullanılması gereken küçük fare gözleri dışında ateş cilalı Pasteur pipetler kullanılır. Pigment epitel hücreleri gen tedavisi yaklaşımları geliştirmek ve patolojik durumları simüle etmek için kullanılabilir, örneğin oksidatif stres hasarı. Bu modeller terapötik ilaçları test etmek için de kullanılabilir.
