이 프로토콜은 5개의 포유동물로부터 안료 상피 세포의 격리 및 이식을 다양한 설정에서 안구 유전자 치료를 연구하는 최적의 시스템으로 서 있기 때문에 중요합니다. 이 방법의 주요 장점은 5종 및 비바이러스 SB100X 트랜스포슨 시스템으로 인한 유연성, 전달성, 높은 세포 수율, 생존율 및 경질속도이다. 이러한 기술은 현재 프로토콜에서 분리되고 전염되는 망막 및 홍채 색소 상피 세포를 표적으로 하는 유전자 치료 접근법을 연구하기 위해 개발되었지만 어떤 안구 연구에도 사용할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자 인 그레그 실리 (Gregg Sealy)가 될 것입니다. 동물을 안락사한 후, 구부러진 가위와 대장균 을 사용하여 눈을 방출한 다음 나머지 근육 조직과 피부를 눈에서 청소하십시오. 비멸 PBS로 채워진 50 밀리리터 튜브에서 눈을 수집하고 라미나르 흐름 후드로 튜브를 전송합니다.
요오드 기반 용액을 2분 동안 잠근 다음 멸균 PBS로 채워진 50 밀리리터 튜브로 눈을 옮기십시오. 멸균 거즈 압축에 한 눈을 넣어 단단히 시신경에 가까운 눈을 잡고. 그런 다음 숫자 11 메스와 홍채의 한계 근처에 잘라.
가위를 사용하여 홍채 를 자르고 전방 세그먼트를 제거하고 페트리 접시에 넣고 망막 색소 상피 또는 RPE 세포가 분리 될 때까지 유리체로 전구를 남깁니다. 홍채 색소 상피 또는 IPE 세포를 분리하려면 미세 한 집게로 렌즈를 제거하고 IPE 세포를 포함하는 홍채를 섬세하게 꺼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 놓고 멸균 PBS로 씻어내라.
섭씨 37도에서 10분 동안 500마이크로리터를 0.25%의 트립신과 인큐베이션으로 추가합니다. 트립신을 제거하고, 500 마이크로리터의 완전한 매체를 추가하고, 평평하고 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 IPE를 섬세하게 긁어냅니다. 세포 현탁액을 수집하고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.
Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산하고, 완전한 배지의 1 밀리리터와 24 우물 판에서 잘 당 0.2 백만 세포를 종자. 접시를 인큐베이터에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. RPE 세포를 격리하려면 얇은 집게로 후방 세그먼트에서 유리체 유머와 망막을 제거합니다.
전구를 24웰 플레이트에 넣고 눈당 0.25%의 트립신 500마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 트립신을 제거하고, 전 세계 에 500 마이크로 리터를 추가하고 곡선, 화재 광택 파스퇴르 파이펫으로 RPE 세포를 섬세하게 긁어. 세포 현탁액을 수집하고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.
Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 이전에 설명한 바와 같이 세포를 시드하십시오. 접시를 인큐베이터에 놓습니다. 눈에서 남은 근육 조직과 피부를 청소하고 요오드 기반 용액으로 눈을 소독하고 PBS로 헹구습니다.
IPE 세포를 격리하려면 렌즈를 제거하고 이전에 설명한 대로 홍채를 꺼냅니다. 두 개의 붓불을 준비한 후, 완전한 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 평평하고 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 긁음으로써 세포를 분리한 다음 세포를 계산하고 시드합니다. 접시를 인큐베이터에 놓습니다.
RPE 세포를 분리하려면 후부 세그먼트에서 유리체와 망막을 제거하고 전구를 페트리 접시에 놓습니다. 전구를 1밀리리터 완전 매체로 채웁니다. 곡면, 불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 RPE 셀을 제거합니다.
1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 전구 내의 세포 현탁액을 수집하고 1.5 밀리리터 튜브로 이송하여 재서스펜션을 합니다. 그런 다음 세포를 계산하고 시드하고 이전에 설명한 대로 플레이트를 배양합니다. 청소 후, 눈을 열고 홍채 주위에 잘라 전방 세그먼트를 제거 한 다음 페트리 접시에 넣어.
RPE 세포가 분리될 때까지 전구를 유리체로 둡니다. IPE 세포를 분리하려면 렌즈가 전방 세그먼트와 함께 있는 경우 렌즈를 제거하고 미세 한 집게를 사용하여 IPE 세포를 포함하는 홍채를 섬세하게 꺼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 놓고 멸균 PBS로 씻어내라.
메스 번호 10으로 섬모 본체를 잘라냅니다. 붓불을 준비한 후 10분 동안 섭씨 37도에서 0.25%의 트립신 2밀리리터로 배양합니다. 트립신을 제거하고 완전한 매체의 두 밀리리터를 추가한 다음, 평평한 불을 닦은 파스퇴르 파이펫으로 긁음으로써 세포를 분리합니다.
세포 현탁액을 2밀리리터 튜브로 옮기고 세포를 120배 G.에서 10분 동안 원심분리하여 수퍼네티드를 버리고 완전한 배지의 2밀리리터로 세포를 재연한다. 완전한 배지의 3밀리리터에서 6개의 웰 플레이트에서 우물당 0.32백만 개의 세포를 시드합니다. 접시를 인큐베이터에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
RPE 세포를 격리하려면, 집게로 후방 세그먼트에서 유리체 유머와 망막을 제거합니다. 망막 안료 상피 손상을 피하십시오. PBS로 전구를 씻으시다.
두 눈을 준비 한 후, 트립신으로 가득 약 3/4에 대한 전구를 채우고, 전구 눈 위에 페트리 접시 뚜껑과 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양. 트립신을 제거하고 완전한 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 곡면, 불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 RPE 셀을 제거합니다.
전구 내의 세포 현탁액을 수집하고 재서스펜션을 위해 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 전체 배지의 3밀리리터에서 6개의 웰 플레이트에서 잘 120배 G.Seed 0.32 백만 세포당 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 접시를 인큐베이터에 놓고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
가습 된 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 세포를 배양합니다. 3 ~4 일 후, 피펫 위아래로 비 부착 된 세포를 수집하고 다른 우물에 볼륨의 절반을 넣어. 완벽한 매체로 1 밀리리터에 우물을 채웁니다.
또 다른 3 ~ 4 일 후, 세포 수집을 반복, 이번에는 두 개의 우물에서 1로 비 부착 세포를 풀링. 모든 우물에 매체를 추가합니다. 세포를 관찰하고 일주일에 두 번 배지를 변경합니다.
세포가 합류에 도달하면 1%의 FBS로 중간을 완료하도록 전환합니다. 전술한 프로토콜을 사용하여 IPE 및 RPE 세포는 성공적으로 분리되어 5개의 다른 종으로부터 배양되었다. RPE 발현 패턴은 RPE65에 대한 면역 형광에 의해 1차 소 IPE 세포에서 확인되었다.
세포 생존능력은 시판적으로 이용 가능한 세포독성 분석 키트 및 매듭 전기화 제어를 사용하여 전기화 완충제의 잠재적 독성을 배제하기 위해 연구되었다. 세포 생존가능성에 미치는 영향은 관찰되지 않았다. 다른 종에서 사전 배양 된 안료 상피 세포는 황형 금성 단백질로 전형화되었다.
감염된 RPE19 세포는 양성 대조군으로 사용하였다. 사전 배양된 돼지 RPE에서의 경질 효율의 정량화는 여기에 나와 있다. 새로 분리된 토끼 색소 상피 세포는 황색 형광 단백질 금성으로 전감염되었고 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다.
안료 상피 세포는 색소 상피 유래 인자와 단백질 분비로 전감염되어 서양 얼룩에 의해 모니터링되었다. 전감염된 세포에 대한 신호는 모든 종 과 며칠 동안 비감염 된 세포와 비교하여 더 높았으며, 이 시간 내에 단백질 분비의 감소가 관찰되지 않았다. 날카로운 도구로 세포를 긁어 하지 않도록 하는 것이 중요 하다.
여기서는 둥근 메스를 사용해야 하는 작은 마우스 눈을 제외하고 불을 닦은 파스퇴르 파이펫이 사용됩니다. 안료 상피 세포는 유전자 치료 접근법을 개발하고 병리학적 조건, 예를 들어 산화 스트레스 손상을 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 또한 치료 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
