הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מהירה, לשחזור ואמינה ליצירת מונוליירים אפיתל מעיים ראשוני ישיר על משטחים שונים עם פסולת מינימלית. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם צריכה נמוכה של מדיה ותחזוקה בעלות נמוכה של תרבות התא. זוהי שיטה מהירה לביצוע בדיקות פונקציונליות ויישומים מהירים במורד הזרם.
פרוטוקול זה יספק תובנה בחקר תיקון פצעים, מחסום חדירות והגירה טרנספיתלאלית מסוגי תאים שונים. כמו כן, מודל זה יכול להיות שימושי באינטראקציה מארח-פתוגן, אפיתל פגום, וגילוי סמים. כדי להתחיל, להוסיף 200 microliters של פתרון ציפוי לכל באר של צלחת 48-well ומגלשה קאמרית.
טרום דגירה שניהם באינקובטור דו תחמוצת הפחמן 5% ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. מעיל 0.4 מיקרומטר קרום התא מוסיף עם 200 microliters של פתרון קולגן. דגירה את הצלחת עם מוסיף הממברנה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן להעביר אותו לחממה 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לחטא עכבר מורדם עם 70% אתנול, ולאחר מכן לנתח את המעי הגס מפי הטבעת כדי cecum בעזרת מספריים ומלקחיים. יש לשטוף בעדינות את הצואה עם PBS קר כקרח במזרק 10 מיליליטר המצויד בצינור הזנה של 20 מילימטרים. הסר את המעי הגס proximal ולהחליק את המעי הגס דיסטלי בעדינות על צינור האכלה 20 מד.
לקשור את המעי הגס בסוף הצינור עם חוט תפר משי 4-0. הפוך את המעי הגס מבפנים החוצה מעל הקצה קשור ולקשור את הקצה השני עם חוט, ולאחר מכן לחתוך את המעי הגס מתחת לקצה צינור ההזנה באמצעות מספריים כירורגיים. פתח בעדינות את הקצה הלא מאוית של המעי הגס ההפוך לקצה מזרק חוזר של 1.25 מיליליטר באמצעות הכועף שלו.
החלק את הקצה הלא קשור של המעי הגס ההפוך אל המזרק וקשר אותו בחוזקה עם חוט. הכנס את הכועף לתוך המזרק ולנפח את המעי הגס עד שהוא נראה טורגנט ללא קמטים גלויים. מניחים את נקניק המעי הגס מנופח בצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פתרון התאוששות התא על קרח במשך 20 דקות.
לנפח ולנפח את המעי הגס פעם בחמש דקות. לקשור את המעי הגס מנופח מתחת לקצה המזרק לחזור באמצעות חוט תפר משי 4-0. חותכים את נקניק המעי הגס את המזרק לחזור ומניחים אותו בצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 50 מילימולאר EDTA במשך 40 דקות.
סובב את הצינור בארבע מעלות צלזיוס. החלף את הפתרון EDTA עם חמישה מיליליטר של חיץ לנער לנער לנער את הנקניק באופן ידני במצב אנכי במשך שתי דקות. תקן את הפתרון רועד לתוך צינור חדש 15 מיליליטר ולחזור על הצעד רועד עד סך של 10 מיליליטר של קריפטות חיץ רועד נאסף.
לספור את מספר הקריפטות ב 20 microliters של המתלה תחת מיקרוסקופ לדלל את המדגם כדי לקבל את הריכוז של חמישה קריפטות לכל microliter. צנטריפוגה דגימת הקריפטה ב 400 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בינתיים, להסיר את צלחת 48-באר וממברנה מוסיף מן החממה ומניחים אותו בארון biosafety.
לשאוף את פתרון הציפוי באמצעות פיפטה P200 ולהשאיר את הצלחת עם המכסה מעט לקזז עד התאים מוכנים להיות מצופה. לאחר צנטריפוגה של השעיית הקריפטה, להסיר את החיץ רועד resuspend גלולה שלם בשלושה מיליליטרים של מדיה שלמה LWRN. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של קריפטות לכל באר של צלחת 48 באר מצופה מראש ומגלשה קאמרית ודגרת שניהם באינקובטור 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
ביום שלמחרת, שאפו את התקשורת והוסיפו מדיה חדשה. בדרך כלל, התאים הופכים להיות משולבים ב 24 עד 48 שעות. עבור מוסיף קרום תרבות התא, להוסיף 200 microliters של קריפטות לחלק העליון של מוסיף ו 600 microliters של מדיה LWRN מלאה לתחתית.
למחרת, שאפו את התקשורת והוסיפו מדיה טרייה רק לתא העליון. דגירה את הצלחת באינקובטור דו תחמוצת הפחמן 5% ב 37 מעלות צלזיוס. למדוד התנגדות חשמלית transepithelial כל יום באמצעות מד וולט אפיתל / אוהם.
לאחר בידוד הקריפטות ממעי הגס מורין ואימות הריכוז, ההשעיה בקריפטה התרכזה לחמישה קריפטות לכל מיקרוליטר. בארות צלחת 48-גם היו נתונים למבחן פצע שריטה עם ההגעה המפגש התא. לאחר 24 שעות, תיקון פצע נצפתה המציין כי התרבות הייתה בריאה ובת קיימא.
ערכי רמה גבוהים יותר הושגו כאשר המדיה שונתה מ- LWRN למדיית בידול. כמו כן, נצפתה ירידה של סמני ISC ועלייה בסמני הבידול המצביעים על כך שהמונוליירים המובחנים נוצרו בהצלחה. בנוסף, המראה של תת סוגים של תאי אפיתל מובחנים הגדלים בתנאים שונים הוכח על ידי כשל חיסוני.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לוודא כי המעי הגס אינו נקרע בשום שלב במהלך ההכנה ונשאר מנופח לשחרר קריפטות בהכנה נקייה מאוד. לאחר יצירת מונוליירים של תאי אפיתל מעיים דו-מימדיים, אנו יכולים לבצע כשל חיסוני, פצעי גירוד וסליעה חדירה ויישומים אחרים במורד הזרם. זה יספק ידע בריפוי פצעים, הגירה של סוגי תאים שונים, ותיקון אפיתל ומחקרי נזק.
