당사의 프로토콜은 최소한의 이물질로 다른 표면에 직접 기본 장 상피 단층층을 생성하는 빠르고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 매체의 낮은 소비와 세포 배양의 저렴한 비용 유지 보수입니다. 기능 테스트와 빠른 다운스트림 응용 프로그램을 수행하는 빠른 방법입니다.
이 프로토콜은 상처 수리, 투과성 장벽 및 다른 세포 유형의 환피적 이동에 대한 연구에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 이 모델은 숙주 병원체 상호 작용, 손상된 상피 및 약물 발견에 유용할 수 있다. 시작하려면 48웰 플레이트 및 챔버 슬라이드의 각 웰에 200 마이크로리터의 코팅 용액을 추가합니다.
2시간 동안 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터 5%를 사전 배양합니다. 콜라겐 용액 200 마이크로리터와 함께 0.4 마이크로미터 세포막 인서트를 코팅합니다. 멤브레인인츠를 섭씨 40도에서 30분간 배양한 다음, 2시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 옮기습니다.
70%에탄올로 안락사 된 마우스를 소독한 다음 가위와 집게의 도움으로 직장에서 cecum로 결장제거합니다. 20 게이지 급지 튜브가 장착된 10 밀리리터 주사기로 얼음 차가운 PBS로 대변을 부드럽게 씻어냅니다. 근위 결장제거를 제거하고 20 게이지 수유 튜브에 탈경 결장과 부드럽게 밀어냅니다.
튜브 끝에 있는 결장을 4-0 실크 봉합사실로 묶습니다. 결장 안쪽을 안쪽으로 뒤집어 서 다른 쪽 끝을 실로 묶은 다음 외과 가위를 사용하여 먹이 튜브의 끝 아래에 결점을 자릅니다. 뒤집힌 결장의 풀이 없는 끝을 플런저를 사용하여 1.25 밀리리터 반복 주사기 끝에 부드럽게 엽니다.
반전된 결장의 단부끝을 주사기에 밀어 내고 스레드로 단단히 묶습니다. 플런저를 주사기에 삽입하고 눈에 보이는 주름없이 긴급해 보일 때까지 결장부림을 부풀려두습니다. 팽창된 결장 소시지를 15밀리리터 튜브에 5밀리리터의 세포 회수 용액을 얼음에 20분 간 놓습니다.
5분마다 한 번씩 결장부풀을 팽창시키고 수축시다. 4-0 실크 봉합사 실을 사용하여 반복 주사기의 끝 아래에 팽창 된 결장을 묶습니다. 콜론 소시지를 반복 주사기에서 잘라 내고 50 밀리리터EDTA10밀리리터가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 40분간 배치합니다.
튜브를 섭씨 4도에서 회전합니다. EDTA 솔루션을 5밀리리터의 쉐이크 버퍼로 교체하고 소시지를 수직 위치에서 2분 동안 수동으로 흔들어 줍니다. 흔들리는 용액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 데킹하고 총 10 밀리리터의 토굴과 흔들림 버퍼가 수집될 때까지 흔들림 단계를 반복합니다.
현미경으로 서스펜션의 20 마이크로 리터에서 토굴의 수를 계산하고 마이크로 리터 당 5 개의 토굴의 농도를 얻기 위해 샘플을 희석. 섭씨 4도에서 10분 동안 400배 G의 토굴 샘플을 원심분리합니다. 그 동안, 인큐베이터에서 48웰 플레이트 및 멤브레인 인서트를 제거하고 생물 안전 캐비닛에 놓습니다.
P200 파이펫을 사용하여 코팅 용액을 흡인하고 세포가 도금 될 준비가 될 때까지 뚜껑을 약간 오프셋하여 플레이트를 둡니다. 토굴 서스펜션의 원심분리 후 흔들림 버퍼를 제거하고 LWRN 완성 매체의 3밀리리터에서 그대로 펠릿을 다시 분리합니다. 미리 코팅된 48웰 플레이트와 챔버 슬라이드의 각 웰에 200 마이크로리터의 토굴을 추가하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 모두 인큐베이션을 넣습니다.
다음 날, 미디어를 흡인하고 신선한 미디어를 추가합니다. 일반적으로, 세포는 24 48 시간에 confluent된다. 세포 배양막 인서트의 경우, 200 마이크로리터의 토굴을 삽입기 의 상단에 추가하고 600 마이크로리터의 완전한 LWRN 배지를 바닥에 넣습니다.
다음 날, 미디어를 흡인하고 상단 챔버에 신선한 미디어를 추가합니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터 5%에 플레이트를 배양합니다. 상피 볼트/옴 미터를 사용하여 매일 환전성 전기 저항을 측정합니다.
뮤린 결장에서 토굴을 격리하고 농도를 확인한 후, 토굴 서스펜션은 마이크로리터 당 5개의 토굴로 집중되었다. 48웰 플레이트 웰은 세포 합류시 스크래치 상처를 입었다. 24시간 후, 상처 수리는 문화가 건강하고 실행 가능하다는 것을 나타내는 관찰되었다.
미디어가 LWRN에서 차별화 미디어로 변경되었을 때 계층 값이 더 높습니다. 또한, ISC 마커의 감소와 분화 마커의 증가가 관찰되어 분화된 단층층이 성공적으로 생성되었음을 나타낸다. 또한, 상이한 조건에서 자란 분화상피 세포의 아형의 출현은 면역형에 의해 나타났다.
이 프로토콜을 시도할 때는 준비 중에 어느 시점에서든 결장이 파열되지 않고 매우 깨끗한 준비로 토굴을 해제하기 위해 팽창되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 2d 장 상피 세포 단층이 형성되면 면역 형광, 긁힌 상처 및 투과성 분석 및 기타 다운스트림 응용 프로그램을 수행 할 수 있습니다. 이것은 상처 치유, 다른 세포 모형의 이동, 및 상피 복구 및 손상 연구 결과에 있는 지식을 제공할 것입니다.
