Наш протокол обеспечивает быстрый, воспроизводимый и надежный метод генерации прямых первичных эпителиальных монослоев кишечника на разных поверхностях с минимальным количеством мусора. Основными преимуществами данного протокола являются низкое потребление среды и низкая стоимость содержания клеточной культуры. Это быстрый метод выполнения функциональных тестов и быстрых последующих приложений.
Этот протокол обеспечит понимание в изучении заживления ран, барьера проницаемости и трансэпителиальной миграции различных типов клеток. Кроме того, эта модель может быть полезна во взаимодействии хозяина и патогена, поврежденного эпителия и открытия лекарств. Для начала добавьте 200 микролитров раствора покрытия в каждую скважину 48-луночной плиты и камерного слайда.
Предварительно инкубируют оба в 5% углекислом инкубаторе при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. Покрыть 0,4-микрометровые клеточные мембранные вставки 200 микролитрами раствора коллагена. Инкубировать пластину с мембранными вставками при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, затем переложить ее в инкубатор диоксида углерода 5% при 37 градусах Цельсия в течение двух часов.
Продезинфицируйте усыпленную мышь 70% этанолом, затем рассеките толстую кишку от прямой кишки до слепой кишки с помощью ножниц и щипцов. Осторожно смойте фекалии ледяным PBS в шприце размером 10 миллилитров, оснащенном питательной трубкой 20 калибра. Удалите проксимальную обивку и осторожно сдвиньте дистальную толстую кишку на питательную трубку 20 калибра.
Обвяжите толстую кишку на конце трубки 4-0 шелковой шовной нитью. Переверните толстую кишку наизнанку через связанный конец и свяжите другой конец ниткой, затем отрежьте толстую кишку ниже кончика питательной трубки с помощью хирургических ножниц. Осторожно откройте развязанный конец перевернутой толстой кишки на кончике повторного шприца 1,25 миллилитра с помощью плунжера.
Сдвиньте развязанный конец перевернутой двоеточия на шприц и плотно завяжите его нитью. Вставьте поршень в шприц и надувайте толстую кишку, пока она не будет выглядеть тургентной без видимых морщин. Поместите надутую колбасу толстой кишки в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров раствора для восстановления клеток, на льду на 20 минут.
Раздувайте и сдувайте толстую кишку раз в пять минут. Завяжите надутую толстую кишку ниже кончика повторного шприца с помощью шелковой шовной нити 4-0. Срежьте колбасу с повторного шприца и поместите ее в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров 50 миллимоляров ЭДТА в течение 40 минут.
Поверните трубку на четыре градуса Цельсия. Замените раствор ЭДТА пятью миллилитрами коктейльного буфера и встряхните колбасу вручную в вертикальном положении в течение двух минут. Декантирование встряхивающего раствора в новую 15-миллилитровую трубку и повторяйте шаг встряхивания до тех пор, пока не будет собрано в общей сложности 10 миллилитров крипт и встряхивающего буфера.
Подсчитайте количество крипт в 20 микролитрах суспензии под микроскопом и разбавьте образец до получения концентрации пяти крипт на микролитр. Центрифугировать образец крипты в 400 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Тем временем извлеките из инкубатора пластинчатые и мембранные вставки с 48 скважин и поместите их в шкаф биобезопасности.
Аспирировать раствор покрытия с помощью пипетки P200 и оставить пластину с крышкой, слегка смещенной, пока ячейки не будут готовы к покрытию. После центрифугирования суспензии крипты удаляют трясущийся буфер и повторно суспендируют неповрежденную гранулу в трех миллилитрах полной среды LWRN. Добавьте 200 микролитров крипт в каждую лунку предварительно покрытой 48-луночной пластины и камерного слайда и инкубируют оба в 5% инкубаторе углекислого газа при 37 градусах Цельсия.
На следующий день аспирировать СМИ и добавить свежие медиа. Как правило, клетки сливаться через 24-48 часов. Для мембранных вставок клеточной культуры добавьте 200 микролитров крипт в верхнюю часть вкладышей и 600 микролитров полной среды LWRN в нижнюю часть.
На следующий день аспирировать медиа и добавлять свежие медиа только в верхнюю камеру. Инкубируют пластину в инкубаторе 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия. Измеряйте трансэпителиальное электрическое сопротивление каждый день с помощью эпителиального вольт/омметра.
После изоляции крипт от мышной кишки и проверки концентрации суспензию крипты концентрировали до пяти крипт на микролитр. 48-скважинные пластинчатые колодцы подвергались анализу на царапины по достижении слияния клеток. Через 24 часа наблюдалось восстановление раны, что указывало на то, что культура была здоровой и жизнеспособной.
Более высокие значения уровня были достигнуты, когда медиа были изменены с LWRN на дифференциационные среды. Кроме того, наблюдалось снижение маркеров ISC и увеличение маркеров дифференциации, что свидетельствует об успешном получении дифференцированных монослоев. Кроме того, было показано появление подтипов дифференцированных эпителиальных клеток, выращенных в разных условиях иммунофлуоресценцией.
При попытке этого протокола важно убедиться, что толстая кишка не разрывается в любой момент во время подготовки и остается надутой, чтобы освободить крипты в чрезвычайно чистой подготовке. Как только образуются монослои 2d-эпителиальных клеток кишечника, мы можем выполнять иммунофлуоресценцию, анализы проницаемости раны царапин и проницаемости и другие последующие применения. Это даст знания в области заживления ран, миграции различных типов клеток, а также исследований восстановления и повреждения эпителия.
