Protokolümüz, farklı yüzeylerde minimum döküntü ile doğrudan birincil bağırsak epitel monolayerleri oluşturmak için hızlı, tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bu protokolün başlıca avantajları, düşük medya tüketimi ve hücre kültürünün düşük maliyetli bakımıdır. İşlevsel testler ve hızlı aşağı akış uygulamaları gerçekleştirmek için hızlı bir yöntemdir.
Bu protokol, farklı hücre tiplerinin yara onarımı, geçirgenlik bariyeri ve transepithelial göçünün incelenmesinde fikir verecektir. Ayrıca, bu model konak-patojen etkileşimi, hasarlı epitel ve ilaç keşfinde yararlı olabilir. Başlamak için, 48 kuyulu bir plaka ve hazne slaydının her kuyusuna 200 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin.
her ikisi de iki saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatır. 0.4 mikrometre hücre zarı uçlarını 200 mikrolitre kollajen çözeltisi ile kapla. Plakayı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede membran uçlarıyla kuluçkaya yatırın, ardından iki saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın.
Ötenazili bir fareyi% 70 etanol ile dezenfekte edin, ardından makas ve tozlar yardımıyla kolonu rektumdan cecum'a kadar parçalara ayırın. 20 kalibrelik besleme tüpü ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınnada buz gibi PBS ile dışkıyı hafifçe boşaltın. Proksimal kolonu çıkarın ve distal kolonu 20 gauge besleme tüpüne hafifçe kaydırın.
Tüpün ucundaki kolonu 4-0 ipek dikiş ipliği ile bağlayın. Kolonu bağlı ucun üzerine ters çevirin ve diğer ucunu iplikle bağlayın, ardından cerrahi makas kullanarak besleme tüpünün ucunun altındaki kolonu kesin. Ters kolonun çözünmemiş ucunu pistonunu kullanarak 1,25 mililitrelik bir tekrar şırınnanın ucuna hafifçe açın.
Ters kolonun çözünmemiş ucunun şırınna kaydırın ve bir iplikle sıkıca bağlayın. Pistonu şırınna yerleştirin ve görünür kırışıklıklar olmadan turgent görünene kadar kolonu şişirin. Şişirilmiş kolon sosisini 20 dakika boyunca buz üzerinde beş mililitre hücre geri kazanım çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Kolonu her beş dakikada bir şişirin ve söndürün. 4-0 ipek dikiş ipliği kullanarak tekrarlanan şırınnanın ucunun altındaki şişirilmiş kolonu bağlayın. Kolon sosisini tekrar şırınnadan kesin ve 40 dakika boyunca 10 mililitre 50 milimolar EDTA içeren 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Tüpü dört santigrat derecede döndürün. EDTA çözeltisini beş mililitre sallama tamponu ile değiştirin ve sosisi iki dakika boyunca dikey konumda manuel olarak çalkalayın. Sallama çözeltisini yeni bir 15 mililitrelik tüpe ayırın ve toplam 10 mililitrelik mahzen ve sallama tamponu toplanana kadar sallama adımını tekrarlayın.
Süspansiyonun 20 mikrolitreslerindeki mahzen sayısını mikroskop altında sayın ve mikrolitre başına beş mahzen konsantrasyonu elde etmek için numuneyi seyreltin. Mahzen örneğini 400 kez G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Bu arada, 48 kuyu plakasını ve membran uçlarını inkübatörden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
Kaplama solüsyonunun P200 pipetini kullanarak emiş ve hücreler kaplanmaya hazır olana kadar plakayı kapakla hafifçe dengede bırakın. Kript süspansiyonunun santrifüjlenmesinden sonra, sallama tamponunu çıkarın ve bozulmamış peletin üç mililitre LWRN komple ortama yeniden itin. Önceden kaplanmış 48 kuyu plakasının ve hazne slaydının her kuyusuna 200 mikrolitrelik mahzen ekleyin ve her ikisini de 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, medyayı arzula ve yeni medya ekle. Genellikle, hücreler 24 ila 48 saat içinde birleşir. Hücre kültürü membran uçları için, kesici uçların üstüne 200 mikrolitre crypt ve alta 600 mikrolitre komple LWRN ortam ekleyin.
Ertesi gün, medyayı arzula ve sadece üst odaya taze medya ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede %5 karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatır. Bir epitel volt /ohm metre kullanarak her gün transepithelial elektrik direncini ölçün.
Bir murine kolondan mahzenleri izole ettikten ve konsantrasyonu doğruladıktan sonra, mahzen süspansiyonu mikroliter başına beş mahzene yoğunlaştı. 48 kuyulu plaka kuyuları hücre birleşmesi üzerine çizik yarası testine tabi tutuldu. 24 saat sonra, kültürün sağlıklı ve canlı olduğunu gösteren yara onarımı gözlendi.
Ortam LWRN'den farklılaştırma ortamına değiştirildiğinde daha yüksek katman değerleri elde edildi. Ayrıca, ISC işaretleyicilerinde bir azalma ve farklılaştırılmış monolayerlerin başarıyla üretildiğini gösteren farklılaşma işaretçilerinde bir artış gözlenmiştir. Ayrıca farklı koşullarda yetişen farklı epitel hücrelerinin alt tiplerinin ortaya çıkması immünofluoresans ile gösterilmiştir.
Bu protokolü denerken, iki noktanın hazırlık sırasında herhangi bir noktada yırtılmasından ve son derece temiz bir hazırlıkta mahzenleri serbest bırakmak için şişirildiğinden emin olmak önemlidir. 2d bağırsak epitel hücre monolayerleri oluştuktan sonra, immünofluoresans, çizik yarası ve geçirgenlik tahlilleri ve diğer aşağı akış uygulamalarını gerçekleştirebiliriz. Bu, yara iyileşmesi, farklı hücre tiplerinin göçü ve epitel onarımı ve hasar çalışmaları hakkında bilgi sağlayacaktır.
