현재까지 임상적으로 검증된 키메라 항원 수용체 T 세포 이미징 플랫폼은 없다. 소듐-요오드화물 심포터는 PET 스캔에 의해 자동차 T 세포를 이미지화하는 민감하고 임상적으로 관련된 리포터를 나타낸다. NIS CAR T-세포의 TLP PET 이미징은 조사자들이 생체내에서 주입된 세포를 비침습적으로 추적할 수 있게 하며, CAR T-세포 요법의 효능 및 독성을 예측할 수 있는 잠재력을 갖는다.
CAR T-세포의 효율적인 이미징은 T-세포 밀매와 확장의 평가를 가능하게 하고, 한계를 극복하기 위한 전략의 개발을 가능하게 한다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 간단하며, 본 연구에 나타난 것 이상의 다른 CAR 구축물에 적용될 수 있다. 표준 밀도 구배 기술을 사용하여 혈액 샘플에서 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 분리하는 것으로 시작하십시오.
이렇게하려면 거품 형성을 피하는 50 밀리리터 밀도 구배 분리 튜브에 15 밀리리터의 밀도 구배 매체를 부드럽게 첨가하십시오. 세포 포획을 피하기 위해, 혈액 샘플을 일대일 부피비로 2%FBS를 함유하는 PBS로 희석하고, 희석된 혈액을 밀도 구배 배지의 상부에 부드럽게 전달하여 둘 사이의 계면을 깨뜨리지 않는다. 그 후 분리관을 실온에서 10분 동안 1, 200배 G에서 원심분리한다.
상층액을 신선한 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고, 튜브를 최대 50 밀리리터 마크까지 채우고, 실온에서 8분 동안 튜브를 300배 G에서 원심분리하여 2%FBS를 함유하는 PBS로 세포를 세척한다. 펠릿화된 세포를 2%FBS를 함유하는 PBS 50 밀리리터에 재현탁시키기 전에 상청액을 흡인한다. 펠릿된 PBMCs를 2%FBS를 함유하는 PBS에 밀리리터당 여섯 번째 세포에 10배 내지 50배의 농도로 재현탁시킨다.
신선한 50 밀리리터 튜브에서 세척을 반복하십시오. 세포 수를 계수한 다음, 실온에서 8분 동안 300배 G에서 세포 현탁액을 원심분리한다. T 세포 분리를 위해, 분리된 PBMC를 14밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 음성 선택 자기 비드 키트를 사용하여 PBMC를 완전 자동화 된 세포 분리기의 음성 선택 항체 칵테일에 배치하여 T 세포 분리를 수행하십시오. T 세포 분리 후, 세포를 계수하고, 밀리리터 당 여섯 번째 세포를 10회 내지 두 배의 농도로 T-세포 확장 배지 또는 TCM에서 배양하였다. 다음에, 항-CD3/CD28 비드를 함유하는 바이알을 소용돌이치면서 혼합하고, 필요한 부피의 비드를 피펫팅하여 멸균된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브 내로 피펫팅한다.
세척을 위해, 튜브를 자석에 놓기 전에 TCM의 한 밀리리터에 비드를 재현탁시키고 상청액을 흡인시킨다. 자석에서 튜브를 제거한 후, 세척된 비드를 TCM 한 밀리리터에 재현탁시키고 세척을 두 번 반복한다. 세척된 비드를 TCM 1밀리리터에 재현탁시켜 이를 T 세포 배양물로 옮긴 다음, 이를 조직 배양물로 옮기기 전에 TCM으로 T-세포 비드 현탁액을 밀리리터당 여섯 번째 세포에 1.0배 1.0배의 농도로 희석하여 여섯 웰 플레이트로 처리하였다.
웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 인큐베이션하십시오. 렌티바이러스의 형질도입과 함께 진행하기 위해, 동결된 렌티바이러스를 섭씨 네 도에서 키메라 항원 수용체 또는 나트륨-요오드화물 교감체로 코팅하여 해동시킨다. 24 내지 48시간의 T 세포 자극 후, T-세포를 혼합하여 클러스터를 분해하고 갓 해동된 렌티바이러스를 다섯 개의 감염의 다중도에서 세포에 첨가한다.
형질도입된 T 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양한다. 배양 셋째, 넷, 다섯 번째 날에, 형질도입된 T 세포를 계수하고, 신선한 미리 가온된 TCM을 첨가함으로써 밀리리터 당 여섯 번째 세포에 1.0배 1.0배로 세포 농도를 조정한다. 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하는 NIS 형질도입된 T 세포의 경우, 세 번째, 네 번째 및 다섯 일에 푸로마이신 디하이드로클로라이드의 밀리리터당 하나의 마이크로그램으로 세포를 처리한다.
여섯째 날에, T 세포 클러스터를 분해하고, 플레이트를 자석 상에 1분 동안 위치시킴으로써 형질도입된 T-세포로부터 항-CD3/CD28 비드를 제거한다. 그 다음 수집된 세포를 다시 1.0배의 농도로 배양물에 넣고 밀리리터당 여섯 번째 세포에 10배의 농도로 배치한다. 50, 000 세포를 함유하는 T 세포 배양물의 분취량을 유동 완충액으로 세척하고, 세포를 50 마이크로리터의 유동 완충액으로 재현탁시킨다.
CAR 발현을 검출하기 위해, T-세포를 한 마이크로리터의 염소 항-마우스 항체로 염색한다. 죽은 세포를 제외하려면 0.3 마이크로 리터의 LIVE / DEAD Aqua를 추가하십시오. 염색된 세포를 실온에서 어둠 속에서 인큐베이션한다.
15분 후, 세포를 섭씨 4도에서 3분 동안 650배 G에서 150 마이크로리터의 유동 완충액으로 세척한다. 염색된 세포를 고정시키고 투과시키기 위해, 세포를 섭씨 네 도에서 20분 동안 100 마이크로리터의 고정 배지로 인큐베이션한다. 그런 다음 사포닌 및 원심분리기와 같은 세포 투과제를 함유하는 완충액 100 마이크로리터로 세포를 두 번 세척한다.
세척 후, 투과화된 세포를 50 마이크로리터의 투과성 완충액에 재현탁시킨다. 그 다음 0.3 나노그램의 항-인간 ETNL NIS 항체를 첨가하고, 섭씨 4도에서 배양한다. 1시간의 인큐베이션 후에, 입증된 바와 같이 150 마이크로리터의 유동 완충액 및 원심분리기를 첨가하여 세포를 세척한다.
이어서, 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 2.5 마이크로리터의 항토끼 이차 항체를 함유하는 50 마이크로리터의 유동 완충액으로 인큐베이션한다. 입증된 바와 같이 T 세포를 세척한 후, 세포를 200 마이크로리터의 유동 완충액에 재현탁시켜 유세포 분석을 수행한다. 그런 다음 세포의 형질도입 효율을 결정한다.
여덟 번째 날에, T-세포를 섭씨 네 도에서 8분 동안 300배 G에서 카운트하고 스핀다운한 다음, 세포 펠릿을 밀리리터당 여섯 번째 세포에 10배 10배의 농도로 동결 배지로 재현탁시켰다. 세포 현탁액 한 밀리리터를 라벨이 붙은 각 냉동 바이알로 옮겨 섭씨 영하 80도 냉동고에서 48시간 동안 보관한다. 48시간 후, T-세포를 액체 질소로 옮긴다.
PET/CT 이미징을 위해 NIS 양성 BCMA CAR T 세포를 주입한 마우스를 준비하여 마우스를 칭량하고 금속 귀 태그를 제거합니다. 그런 다음 갓 준비한 F18 테트라플루오로보레이트의 9.25 메가베크렐을 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 정맥 주사합니다. 흡수 기간 45분 후, 15분 동안 마취된 마우스의 정적 PET 이미지 획득을 진행하고, 이어서 360도 회전 및 180도 프로젝션으로 5분 동안 CT 이미지 획득을 진행한다.
이 대표적인 분석에서, 두 바이러스를 T 세포로 공동-형질도입하여 NIS 양성 BCMA CAR T-세포를 생성하였으며, 여기서 세포의 90% 이상이 NIS 양성이었다. 0일에서 여덟 일까지의 T 세포 성장 동역학을 분석한 결과, BCMA CAR 및 NIS의 혼입은 형질도입되지 않은 세포와 비교했을 때 T 세포 확장에 유의한 영향을 미치지 않았다는 것이 밝혀졌다. OPM-2의 유세포 분석에서, 렌티바이러스로 형질도입된 세포는 퓨로마이신으로 처리시 GFP 발현을 나타내었다.
BCMA 양성 루시퍼라아제 양성 OPM-2 세포를 투여받은 마우스는 OPM-2 세포의 생착을 확인하기 위해 생체발광 이미징을 실시하였다. F18 테트라플루오로보레이트 투여된 마우스의 PET 영상화는 다양한 기관 및 골수에서 NIS 양성 BCMA CAR T 세포 분포를 밝혀냈다. 추가적으로, 마우스로부터 수확된 골수 세포는 OPM-2 세포의 생착 및 NIS 양성 BCMA CAR T 세포의 골수로의 전달을 나타내었다.
주입된 CAR T-세포의 고품질 이미징을 위해서는 NIS CAR T 세포 생성 프로토콜의 단계를 따르고 이중 NIS 및 CAR 양성 분획의 존재를 확인하는 것이 중요하다.
